菜籽粕蛋白提取及其氨基酸分析

周天驹，丁之恩

（安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥230036）

在我国，油菜籽作为油料作物具有重要地位，年产量在1×106万吨以上[1]，油菜籽榨油后的副产品为菜籽粕，其含有35%～45%的蛋白质[2]，而菜籽粕只是少量加入饲料作为使用，造成了这一资源严重浪费，因此菜籽粕是一种潜在的植物蛋白来源，研究开发价值很高。

菜籽蛋白中谷氨酸丰富，并且必需氨基酸组成比较平衡[3]，几乎不存在限制性氨基酸，其营养符合世界卫生组织（WHO）与联合国粮农组织（FAO）的推荐模式[4]。植物蛋白的主要提取主要有沉淀法、膜分离和离子交换等方法[5-6]。本文以菜籽粕为原料依次采用碱法提取和酸法提取分步提取蛋白质，并采用正交组合试验，优化提取菜籽粕蛋白质的工艺，以期获得较好的蛋白质提取率和较高的蛋白质纯度，同时对所得菜籽粕蛋白质进行氨基酸组成分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菜籽粕：安徽省合肥市肥西县小苗镇雷麻加工厂。

五水合硫酸铜、氢氧化钠、盐酸等试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；S200-k梅特勒-托利多多参数测试仪、梅特勒-托利多ML204/02电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；EYELA冷冻干燥机：上海爱郎仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司；海能K9840自动凯氏定氮仪：济南海能仪器有限公司；日本Hitachi L-8900全自动氨基酸分析仪：日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 主要成分分析及蛋白含量的测定

灰分：GB 5009.4-2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》；粗纤维：GB/T 5009.10-2003《植物类食品中粗纤维的测定》；还原糖：GB 5009.7-2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》；总糖：GB/T 15672-2009《食用菌中总糖含量的测定》；总蛋白：GB 5009.5-2010《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》。

提取蛋白：双缩脲法。具体步骤如下：以牛血清蛋白为对照，建立回归方程，得出回归方程为A=3.873 0C+0.033 6（R2=0.997 2），式中：C 为吸光度，A为蛋白质的浓度（g/L）。

菜籽粕中蛋白质的提取率/%=（提取液中蛋白质含量/菜籽粕总蛋白质含量）×100

1.3.2 菜籽粕蛋白质最佳析出pH值的测定

取适量的菜籽粕与水按1∶15（g/mL）混合，用1 mol/L NaoH调 pH至 12，50℃水浴振荡 1 h，在5 000 r/min离心5 min，取等量上清液，调至不同pH值沉淀蛋白质，离心后，用双缩脲法测定沉淀后上清液中蛋白质的残留含量，上清液中蛋白质残留最低的pH值为菜籽粕蛋白质的最佳沉淀pH值[7]。

上清液蛋白质残留率/%=（不同pH沉淀后上清液中蛋白质含量/菜籽粕总蛋白质含量）×100

1.3.3 菜籽粕蛋白质分步提取工艺

1.3.3.1 第一步碱法提取菜籽粕蛋白质

称取样品1g→加水调料液比、调pH值（NaOH）→水浴（控制温度和时间）→离心5 min（5 000 r/min）→上清液双缩脲测蛋白质→沉淀烘箱烘干

1.3.3.2 第二步酸法提取菜籽粕蛋白质

称取烘干后菜籽粕样品1 g→加水调料液比、调pH（NaOH）→水浴（控制温度和时间）→离心5 min（5 000 r/min）→上清液双缩脲测蛋白质

1.3.4 菜籽粕蛋白质提取最适条件的确定

考察pH值、时间、料液比、温度对提取菜籽粕蛋白率的影响。把温度45℃，时间3 h，料液比1∶30（g/mL），设为初始条件，碱法在 9.0、10.0、11.0、12.0、13.0改变pH值，考察pH值对提取菜籽粕蛋白质的影响；确定适宜的pH值后，在料液比1∶10、1∶15、1∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）范围内，考察底物浓度的影响；确定适宜的pH值和料液比后，不改变其他因素的情况下，在提取时间 1、2、3、4、5 h，考察时间的影响；以上3因素确定后，在提取温度在35、40、45、50、55℃之间，确定适宜的温度。第二步酸法在0.5～2.5改变pH值，其余条件与碱法相同。1.3.5 菜籽粕蛋白质提取的正交试验

根据碱法、酸法单因素的试验结果，分别选取L9（34）正交表进行优化菜籽粕提取蛋白质的正交试验。

2 结果与分析

2.1 菜籽粕原料的主要成分分析

菜籽粕原料的主要成分结果见表1。

表1 菜籽粕主要成分Table 1 The main components of rapeseed dregs

由表1可知，菜籽粕中的粗蛋白和总糖含量比较高，具有很好的潜在利用价值。

2.2 菜籽粕蛋白等电点分析

菜籽粕蛋白的等电点结果如图1所示。

由图1可看出，菜籽粕蛋白在不同pH值的条件下，上清液中的蛋白含量随着pH值的增加呈现先降低后升高的趋势，在pH=5时最低，暗示了菜籽粕蛋白在pH为5时析出的最多，即为菜籽粕蛋白质的等电点。

2.3 菜籽粕蛋白碱法提取的单因素试验

2.3.1 碱法pH值对蛋白提取率的影响

碱法pH值对菜籽粕蛋白提取率的影响如图2所示。

图1 菜籽粕蛋白的等电点分析Fig.1 The isoelectric point analysis of rapeseed dreg protein

图2 碱法pH值对菜籽粕蛋白提取率的影响Fig.2 The effect of pH on the rapeseed dreg protein extraction efficiency in alkali method

由图2可知，随着pH值的上升，蛋白质的提取率也随之上升，当pH值为12时，提取率为50.41%；pH值为13时最大为54.81%，但当pH超过13时可能会引起蛋白理化性质的改变，降低其营养价值[8]，因此初步确定最佳pH值为12。

2.3.2 碱法料液比对蛋白质提取率的影响

碱法料液比对菜籽粕蛋白提取率的影响如图3所示。

图3 碱法料液比对菜籽粕蛋白提取率的影响Fig.3 The effect of solid-liquid ratio on the rapeseed dreg protein extraction efficiency in alkali method

由图3可知，料液比对蛋白质提取率的先升高后趋于平缓，料液比过高，蛋白质的提取率并没有显著增加，反而增加了后续的处理负担，初步确定料液比为 1 ∶15（g/mL）。

2.3.3 碱法提取时间对蛋白质提取率的影响

碱法提取时间对菜籽粕蛋白提取率的影响如图4所示。

图4 碱法提取时间对菜籽粕蛋白提取率的影响Fig.4 The effect of extraction time on the rapeseed dreg protein extraction efficiency in alkali method

由图4可知，当提取率时间为2 h时，蛋白质提取率基本达到最高为45.69%，再增加提取时间，蛋白质提取率并没有明显提高。为了缩短生产周期，初步确定提取时间2 h。

2.3.4 碱法提取温度对蛋白质提取率的影响

碱法提取温度对菜籽粕蛋白提取率的影响如图5所示。

法国心理学家勒庞认为，人一到群体中就变得低智商、非理性、易盲从，于是他把人群称为“乌合之众”，著有著名的畅销书《乌合之众：大众心理研究》，这本书在国内也备受推崇。勒庞的看法只是一家之言，未见得便是真理，譬如与他同时代的另一位法国心理学家塔尔德便提出了几乎相反的观点。但个体受群体影响，却是没有疑义的。

图5 碱法提取温度对菜籽粕蛋白提取率的影响Fig.5 The effect of extraction temperature on the rapeseed dreg protein extraction efficiency in alkali method

由图5可知，随着温度的升高，提取率缓慢增加。当提取温度为45℃时，蛋白质提取最高为52.25%，初步确定提取温度为45℃。

2.3.5 碱法正交试验

以 pH 值（A）、料液比（B）、温度（C）、时间（D）4个单因素设计正交试验，因素水平表、试验设计及结果见表2和表3，方差分析见表4。

由表3中R值可知，4个影响菜籽粕蛋白提取率因素的顺序是A＞B＞D＞C，即pH值＞料液比＞时间＞温度。在表3中，当pH值13，料液比1∶20（g/mL），温度45℃和时间1 h时，菜籽粕蛋白的提取率最高，为67.93%。而从k值分析得知，碱法提取菜籽粕蛋白的最佳组合为A3B2C2D1，即pH值13，料液比1∶15（g/mL），温度 45 ℃和时间 1 h，此时的提取率为67.86%，与表3中的最高提取率无显著性差异。因此，出于节约原料和成本的考虑[8]，碱法提取菜籽粕蛋白的最佳条件：pH 13，料液比 1 ∶15（g/mL），温度45℃和时间1 h，此时的菜籽粕蛋白的提取率为67.86%。并按最佳工艺进行验证试验，测得的菜籽粕蛋白提取率为67.90%，与之前的结果一致，说明该工艺具有重复性。

表2 因素水平表Table 2 Factors and levels table

表3 碱法正交试验设计及结果Table 3 The orthogonal experimental design and results of alkali method

表4 碱法方差分析Table 4 The variance analysis of alkali method

由表4的方差分析可知，pH值对碱法蛋白质提取有显著性影响，而料液比、时间和温度对其提取率影响不显著。

2.4 菜籽粕蛋白酸法提取的单因素试验

2.4.1 酸法pH值对蛋白提取率的影响

酸法pH值对菜籽粕蛋白提取率的影响如图6所示。

图6 酸法pH值对菜籽粕蛋白提取率的影响Fig.6 The effect of pH on the rapeseed dreg protein extraction efficiency in acid method

由图6可知，当pH值为1时，提取率为33.16%；pH值为0.5时，提取率为最大35.07%，初步确定最佳pH值为0.5。

2.4.2 酸法料液比对蛋白质提取率的影响

酸法料液比对菜籽粕蛋白提取率的影响如图7所示。

图7 酸法料液比对菜籽粕蛋白提取率的影响Fig.7 The effect of solid-liquid ratio on the rapeseed dreg protein extraction efficiency in acid method

2.4.3 酸法提取时间对蛋白质提取率的影响

酸法提取时间对菜籽粕蛋白提取率的影响如图8所示。

图8 酸法提取时间对菜籽粕蛋白提取率的影响Fig.8 The effect of extraction time on the rapeseed dreg protein extraction efficiency in acid method

由图8可知，当提取率时间为2 h时，蛋白质提取率基本达到最高为32.13%，再增加提取时间，蛋白质提取率并没有明显提高，因此初步确定提取时间2 h。

2.4.4 酸法提取温度对蛋白质提取率的影响

酸法提取温度对菜籽粕蛋白提取率的影响如图9所示。

图9 酸法提取温度对菜籽粕蛋白提取率的影响Fig.9 The effect of extraction temperature on the rapeseed dreg protein extraction efficiency in acid method

由图9可知，蛋白质的提取率先升后降。当提取温度为45℃时，蛋白质提取最高为35.67%，初步确定提取温度为45℃。

2.4.5 酸法正交试验

以 pH（E）、料液比（F）、温度（G）、时间（H）4个单因素设计正交试验，因素水平表和试验设计及结果见表5和表6，方差分析见表7。

表5 因素水平表Table 5 Factors and levels table

表6 酸法正交试验设计及结果Table 6 The orthogonal experimental design and results of acid method

表7 酸法方差分析Table 7 The variance analysis of acid method

由表6中R值可知，4个影响菜籽粕蛋白提取率因素的顺序是F＞E＞G＞H，即料液比＞pH值＞温度＞时间。在表 6中，当 pH 值 0.5，料液比 1∶15（g/mL），温度45℃和时间2 h时，菜籽粕蛋白的提取率最高，为36.10%。

而从k值分析得知，酸法提取菜籽粕蛋白的最佳组合为 E1F2G3H2，即 pH0.5，料液比 1 ∶15（g/mL），温度50℃和时间2 h，此时的提取率为35.32%，低于表3中的最高提取率。因此，酸法提取菜籽粕蛋白的最佳条件：pH 0.5，料液比 1 ∶15（g/mL），温度 45 ℃和时间2 h，菜籽粕蛋白的提取率为36.10%。并按最佳工艺进行验证试验，测得的菜籽粕蛋白提取率为36.25%，略高于表6中的最高提取率。

由表7的方差分析可知，料液比对酸法蛋白质提取有显著性影响，而pH值、时间和温度对其提取率影响不显著。

2.5 菜籽粕蛋白的氨基酸分析

2.5.1 菜籽粕蛋白质的氨基酸分析

菜籽粕蛋白的氨基酸组成与含量如表8所示。

表8 菜籽粕蛋白的氨基酸组成与含量Table 8 Amino acid composition and content of the rapeseed dreg protein g/100 g

从表8可以看出，菜籽粕蛋白质的氨基酸含有7种必需氨基酸，占总氨基酸的29.41%。全部氨基酸中谷氨酸的含量最高为25.96%，其中精氨酸的含量明显高于FAO/WHO/UNU 1985年的推荐值[9]，亮氨酸与苏氨酸也推荐值相近。

2.5.2 菜籽粕蛋白质必需氨基酸组成

菜籽粕蛋白的必需氨基酸组成如表9所示。

表9 菜籽粕蛋白质必需氨基酸组成Table 9 Essential amino acid composition of the rapeseed dreg protein%

由表9可以看出，菜籽粕蛋白必需氨基酸组成。菜籽粕粗蛋白的必需氨基酸占氨基酸总量的35.6%，高于淮山药[10]，与FAO/WHO模式标准蛋白[11]相当。

3 讨论

以碱法和酸法分步提取菜籽粕蛋白，通过正交试验优化了菜籽粕蛋白提取的工艺流程。在试验过程中发现，在碱法提取的菜籽粕蛋白的提取率可达67.86%，碱法提取菜籽粕蛋白更加适合工业生产。同时通过对提取的菜籽粕蛋白氨基酸分析可知，菜籽粕的氨基酸组成丰富，与FAO/WHO模式标准蛋白相当。

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