电场对三疣梭子蟹微冻贮藏过程中品质的影响

李苑，王丽平，余海霞，杨水兵，胡亚芹，*

（1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，馥莉食品研究院，浙江省食品加工技术与装备工程中心，浙江省农产品加工技术研究重点实验室，浙江杭州310058；2.浙江大学舟山海洋研究中心，浙江舟山316021）

三疣梭子蟹是一种肉质细嫩的甲壳类生物[1]，具有高蛋白、低脂肪的特点，是一种被人们广泛喜爱的水产品[2]。然而由于其肌肉结构组织松散，梭子蟹死后发生复杂的物理、化学及生化变化，体内蛋白质、脂肪等被内源和外源的酶或微生物分解成小分子的产物，并且被腐败微生物利用，在质构、营养上都发生巨大的变化，并产生挥发性物质等，影响其风味及食用价值[3-4]。因此，选择合适的方法对三疣梭子蟹进行保藏，延长其货架期，具有重要的意义。

目前水产品的保鲜技术主要有低温保鲜技术[5-6]、生化保鲜技术[7-8]、高压保鲜技术[9-10]、气调保鲜技术等[11]。随着科技的发展和人们对于水产品品质要求的提高，新的保鲜方法例如冰温保鲜[12]、辐照保鲜[13]、臭氧保鲜[14]、微冻保鲜等也被研究和逐步应用。

微冻保鲜是将贮藏温度控制在低于被冻结生物体冰点1℃～2℃的一种保鲜技术，与传统的冷藏技术相比，微冻保鲜使得微生物的生长得到更好的抑制，从而起到延长货架期的作用[15]；与传统的冷冻技术相比，微冻过程中水产品部分结冰，通过抑制冰晶的生成，控制了冰晶对肌肉组织的损害，控制水分的流失[16]。但是微冻对于环境温度的要求较高，很小的温度波动都会使得肌肉中的冰晶大量生长[17]。

冰晶的形成分为晶核形成和晶体生长两步。在水分冻结的过程中，电场对水分子施加力矩，破坏其平衡状态，从而使得晶核的形成受到抑制[18]。同时，电场的引入可以造成水与酶结合状态的变化，使得酶失活[19]。电场同时具有一定的杀菌作用，电穿孔模型是其中广为接受的理论。电场也可以通过增大细胞的跨膜电位，使得细胞膜通透性增强，细胞质流出而造成细胞的死亡[20]。

目前对于电场保鲜已经有一些研究。Ko等[21]对罗非鱼在高压静电场中进行处理，杀菌效果比较明显。Ko等[22]研究也发现高压静电场可以有效的抑制罗非鱼的盐溶性蛋白含量下降。陈建荣等[23]研究发现电场处理的鱼贮藏期得到了延长。然而在微冻过程中引入电场的研究还很少。在微冻过程中加入电场，可以起到抑制冰晶生成的作用，在一定程度上减少微冻过程中冰晶对水产品造成的损伤。本研究采用三疣梭子蟹为原料，将其分别进行有电场参与和无电场参与的微冻保鲜，通过对其贮藏过程中各项指标进行测定，包括与蛋白相关的挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）、SDS-PAGE电泳，与脂肪氧化相关的硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、与微生物生长相关的菌落总数（total viable count，TVC）以及微观组织成分观察，比较有无电场参与对于微冻过程的影响，为电场与微冻结合对水产品的保鲜提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜舟山三疣梭子蟹：浙江省舟山市国际水产城，选取重量约100.0 g～150.0 g的新鲜三疣梭子蟹，放入装有碎冰的泡沫盒中40 min内运回实验室。

三 氯 乙 酸 、 氧 化 镁 、CuSO4、NaOH、HCl、NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、2-硫代巴比妥酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。三羟甲基氨基甲烷、四乙基乙二胺、过硫酸铵、丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

L93-2L温度记录仪：杭州路格科技有限公司；YD202A石蜡切片机、D-A智能型生物组织摊片机、YD-B智能型生物组织烤片机：浙江省金华益迪医疗设备厂；DKS-12电热恒温水浴锅：嘉兴市中新医疗仪器有限公司；TGL-16G高速台式离心机：上海安亨科学仪器厂；FLY-YS-108L恒温保存箱：北京福意电器有限公司；UV-1800PC紫外-可见分光光度计：上海美普达有限公司；XBLL-23A绞肉机：上海帅佳电子科技有限公司；AR124CN分析天平：美国 Ohaus公司；Tanon EPS 300垂直电泳仪：上海天能科技有限公司。

1.3 样品处理

将活的三疣梭子蟹流水清洗5 min后，沥干水分用自封袋包装，分别置于-3℃普通微冻冰箱（P组）和-3℃电场微冻冰箱（D组）进行保鲜。

电场微冻冰箱内部左右两侧置有电场，其发射电源为220 V，经变频器输出为3 000 V。

1.4 冻结曲线的测定

将温度记仪设置为30 s记录一次温度后，将温度探头插入三疣梭子蟹腹部肌肉中，将三疣梭子蟹放入-18℃冰箱中，温度随时间变化的曲线即为冻结曲线。试验测定3次。根据冻结曲线得到三疣梭子蟹的冻结点，并确定其微冻温度。

1.5 TVB-N的测定

参照GB 5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》中半微量定氮法进行TVB-N的测定。

1.6 肌原纤维蛋白的提取

肌原纤维蛋白的提取按照Lefever等[24]的方法来进行。取约20 g样品，加入10倍体积的缓冲液A（100 mmol/L NaCl-1 mmol/L EDTA-20 mmol/L磷酸缓冲液，pH7.0），匀浆30min后在4℃下1000g（3000r/min）离心15 min。向离心所得的沉淀中加入5倍体积的缓冲液A，按上述条件再次离心。弃去上清液后，向沉淀中加入5倍体积的缓冲液A进行过滤，然后将沉淀用5倍体积的缓冲液A进行冲洗，得到的滤液再在相同条件下进行离心，得到沉淀。该过滤离心的过程重复2遍～3遍，最后得到的沉淀用5倍体积的缓冲液B（1 mol/L NaCl-50 mmol/L磷酸缓冲液，pH7.0）溶解，匀浆离心后的上清液，即为肌原纤维蛋白溶液。

1.7 SDS-PAGE电泳

SDS-PAGE电泳过程按照刘文娟[25]的方法进行并稍加改动。将按照1.6提取的5 mL肌原纤维蛋白溶液样品和5 mL双缩脲试剂混合后，在25℃下水浴1.5 h。用可见光紫外分光光度计于540 nm处测定吸光值，与牛血清蛋白标准蛋白曲线对照得到蛋白浓度，并用缓冲液B调整浓度至4 mg/mL。按样品∶蛋白上样缓冲液为1∶4（体积比）的比例处理样品，样品在95℃加热5 min后冷却，然后上样10 μL。电泳分离胶为12%，浓缩胶为5%。恒压100 V下进行电泳。染色使用考马斯亮蓝溶液进行。脱色后观察蛋白条带的变化。

1.8 TBA的测定

TBA的测定参照Siu等[26]的方法进行并稍加改动。将5.0 g样品搅碎后，加入25 mL含有0.1%的EDTA溶液，振摇30 min后，混合物用双层滤纸过滤，取5 mL上清液加入0.02mol/L的TBA溶液5mL，沸水浴40min后流水冷却，5 000 r/min离心20 min，取上清液加入5 mL氯仿摇匀，静置后取上清液，分别在532 nm和600 nm处测定吸光值，按以下公式计算TBA值：

TBA/（mg/100 g）=（A532-A600）/155×（1/10）×（1/10）×72.6×100

1.9 TVC的测定

TVC的测定参照Wu等[27]的方法进行，并加以改动。向无菌袋中加入10.0 g样品和90 mL0.9%的无菌生理盐水，均质5 min后，使用无菌生理盐水对悬浮液进行体积比为1∶10的连续稀释。再分别吸取1 mL不同浓度稀释液于灭菌培养皿内（每个稀释浓度两个平行，两个空白），将冷却至46℃左右的营养琼脂培养基注入培养皿，混合均匀，在琼脂冷却至凝固后，将接种好的平板在30℃恒温培养箱中培养72 h，计数方法采用平板计数法。试验结果以lg（CFU/g）表示。

1.10 肌肉组织微观结构形态观察

参照胡玥等[28]的方法，三疣梭子蟹从腹部肌肉取样，大小为5 mm×5 mm×10 mm，进行垂直于肌原纤维方向的横切，肌肉的微观组织结构在400×的光学显微镜下进行观察。

1.11 统计方法

所有试验至少重复3次，数据以平均值及方差表示。使用Excel 2007、SPSS 16.0软件以及方差分析（ANOVA）进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 三疣梭子蟹冻结曲线分析及微冻温度的确定

三疣梭子蟹的冻结曲线如图1所示。

图1 三疣梭子蟹冻结曲线Fig.1 Freezing curve of Pseudosciaena polyactis

随着时间的延长，三疣梭子蟹的中心温度首先迅速降低，在第24 min左右到达第一个拐点，温度为-2.6℃。冻结曲线中出现的第一个拐点为物料的冻结点。到达第一个拐点之后，随着冻结过程的继续进行，三疣梭子蟹的温度没有显著下降，即通过最大冰晶生成带。在该过程中，肌肉中大部分水分形成冰晶。在通过最大冰晶生成带后，继续冻结，三疣梭子蟹温度继续下降，直到达到环境温度（-18℃）并保持稳定。根据微冻温度在冻结点1℃～2℃的定义，综合考虑仪器实际情况及三疣梭子蟹的冻结点，选择-4℃对三疣梭子蟹进行贮藏。

2.2 两种条件贮藏过程中三疣梭子蟹TVB-N变化

挥发性盐基氮（TVB-N）是水产品体内由于酶和微生物的作用而使蛋白质等分解产生碱性物质的总称，一般用于反映水产品的新鲜程度[29]。普通微冻和电场微冻贮藏过程中三疣梭子蟹的TVB-N值的变化如图2所示。

随着贮藏时间的延长，两组的TVB-N值都呈现了上升的趋势，代表着三疣梭子蟹在贮藏过程中品质的下降。电场微冻组表现出比普通微冻组缓慢的上升趋势，这与Ko等[21]的研究结果一致。在贮藏第25天时，普通微冻组（P）和电场微冻组（D）的TVB-N值分别为26.1 mg/100 g和22.3 mg/100 g，根据GB 2733-2015《食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品》的要求，海蟹中的TVB-N值应≤25 mg/100 g，普通微冻组在贮藏第25天已超过海蟹TVB-N值应≤25 mg/100 g的标准，为不可食状态。在贮藏第31天，电场微冻组的TVB-N值达到25.2 mg/100 g，达到不可食用状态。电场的添加可能通过抑制酶和微生物的活力达到了减缓三疣梭子蟹腐败，从而达到延缓体内挥发性盐基氮增加的作用[30]。

图2 普通微冻及电场微冻条件下三疣梭子蟹TVB-N变化Fig.2 Changes of TVB-N in Pseudosciaena polyactis during storage of regular superchilling and electric field superimposed superchilling

2.3 两种条件贮藏过程中三疣梭子蟹SDS-PAGE电泳分析

普通微冻及电场微冻条件下，贮藏第7、16、28天时三疣梭子蟹的肌原纤维SDS-PAGE电泳图谱如图3所示。

图3 普通微冻及电场微冻条件下三疣梭子蟹肌原纤维SDSPAGE电泳图谱Fig.3 Electrophoresis of Pseudosciaena polyactis during storage of regular superchilling and electric field superimposed superchilling

在图3P组三疣梭子蟹的电泳图谱中，肌球蛋白的条带（130 k左右）随着贮藏时间延长逐渐溶解，而250 k左右的蛋白条带明显加粗，这可能是由于肌原纤维中二硫键和二酪氨酸的形成导致的蛋白聚集[31]。与普通微冻组相比，电场微冻组250 k处的蛋白质聚集显示出了较慢的聚集，一方面，这可能与电场的杀菌作用导致三疣梭子蟹的腐败进程减缓，蛋白质分解速度较普通微冻慢；另一方面，电场对冰晶的形成具有抑制作用，冰晶形成的减少减弱了冰晶对于组织细胞的挤压，从而延缓了蛋白质的变性。

2.4 两种条件贮藏过程中三疣梭子蟹TBA变化

水产品中的脂肪，尤其是不饱和脂肪酸容易氧化变质或者因受到微生物等的影响而腐败，TBA值为判定脂肪氧化程度的一个指标。普通微冻和电场微冻过程中三疣梭子蟹的TBA值变化如图4所示。

图4 普通微冻及电场微冻条件下三疣梭子蟹TBA变化Fig.4 Changes of TBA in Pseudosciaena polyactis during storage of regular superchilling and electric field superimposed superchilling

随着贮藏时间的延长，两组的TBA值都呈现上升趋势。电场微冻组相对普通微冻组显示出了较慢的TBA值增长趋势，在贮藏第35天，普通微冻组和电场微冻组TBA值分别达到了0.48 mg/100 g和0.58 mg/100 g。Ko等[21]认为，这可能与电场的加入有关，电场会使得电荷在水产品表现形成，从而隔绝了氧气的进入，减缓了脂肪氧化的发生。另一方面，电场通过抑制冰晶形成，减缓了冰晶对细胞的破坏，减缓了水产品腐败进程，因此电场微冻组TBA值的增加减慢。

2.5 两种条件贮藏过程中三疣梭子蟹TVC变化

菌落总数（TVC）是反映水产品新鲜程度的重要指标。梭子蟹营养丰富，水分含量高，外界微生物也容易侵染。图5反映了普通微冻和电场微冻条件下三疣梭子蟹肌肉内TVC的变化情况。随着贮藏时间的延长，普通微冻和电场微冻的菌落总数都是不断增加，贮藏后期TVC的增加较前期快。电场微冻组菌落总数增加较普通微冻组慢。在贮藏第34天，电场微冻组和普通微冻组的TVC值分别达到6.40 lg（CFU/g）和7.53 lg（CFU/g）。这很可能是由于电场所具有的杀菌作用。

2.6 三疣梭子蟹肌肉组织微观结构形态观察

图6表示了贮藏第10天和第31天时普通微冻及电场微冻条件下三疣梭子蟹微观结构的变化。

如图6所示，在贮藏第10天，三疣梭子蟹肌肉细胞之间出现了比较小的缝隙，其中电场保鲜组的缝隙比较均匀，而普通微冻组存在一些不均匀的缝隙。随着贮藏的进行，电场微冻组（D）在第31天依然表现为较为均匀的肌肉组织间隙，而普通微冻组（P）则有明显的冰晶聚集和肌肉纤维造成的粗细不一的空隙。这可能与电场抑制了冰晶的生长有关。Kaale等[32]认为，在有外部电场作用的情况下，由于平行于电场方向的水分子需要克服的位能低，容易克服固液界面阻力，完成从水到冰晶的转变。因此除平行于电场方向的冰晶形成都受到抑制。

图5 普通微冻及电场微冻条件下三疣梭子蟹TVC变化Fig.5 Changes of TVC in Pseudosciaena polyactis during storage of regular superchilling and electric field superimposed superchilling

图6 普通微冻及电场微冻条件下三疣梭子蟹肌肉微观组织变化Fig.6 Changes of microstructure in Pseudosciaena polyactis during storage of regular superchilling and electric field superimposed superchilling

3 结论

以三疣梭子蟹为对象，对比研究普通微冻和电场微冻两种方法下其在贮藏过程中理化性质和肌肉微观结构的影响。电场微冻相对普通微冻，更好地维持了三疣梭子蟹在贮藏过程中的品质，延缓了酶和微生物对肌肉的破坏，脂肪氧化速度减慢，肌肉微观组织破坏程度也相对较低。电场微冻减缓了三疣梭子蟹的变质，延长了其货架期。本研究将电场与微冻技术结合，为水产品保鲜提供了新的思路。

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