DTAC反胶束W o值对萃取蛋白质乳化性的影响

左锦静，姚永志

（1.河南工业贸易职业学院，河南郑州451191；2.河南工业大学粮油食品学院，河南郑州450000）

乳化性是大豆蛋白质最重要的功能性质之一，在食品的应用中具有重要价值。大豆蛋白质的乳化性与蛋白质分子大小、构象、氨基酸组成以及电荷分布有关。人们为了提高大豆蛋白质的乳化性进行了许多的研究[1-6]，提高蛋白质的乳化能力和乳化稳定性以及适用范围一直是食品科学领域的一个研究重点。但是利用十二烷基三甲基氯化铵（dodecyltrimethyl ammonium chloride，DTAC） 反胶束萃取技术生产的大豆蛋白质乳化性的研究鲜见报道。

反胶束萃取技术是一种适于生物大分子（如蛋白质）分离纯化的新技术，被研究者广泛用来研究溶菌酶、α-淀粉酶、细胞色素-C和植物蛋白质的分离萃取。反胶束常用的表面活性剂有丁二酸二异辛酯磺酸钠（sodium bis-（2-ethylhexyl）sulfosuccinate，AOT）、十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）等。程小丽等[7]研究了新的十二烷基三甲基氯化铵（DTAC）反胶束体系的配制，同时研究得到DTAC/正庚烷-正己醇反胶束体系Wo值较大，对大豆蛋白的实际萃取率高。

本文采用DTAC/正庚烷-正己醇反胶束体系，研究了不同Wo值萃取蛋白质样品乳化活性和乳化稳定性的影响，并通过分析蛋白质样品构象的变化和表面疏水性的变化，研究不同Wo值影响蛋白质乳化性的机理，这些理论对于掌握反胶束萃取蛋白质的乳化性特点以及应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低温脱脂豆粕：过100目筛，安阳漫天雪食品制造有限公司。

十二烷基三甲基氯化铵（DTAC）（生物级）：安徽奔马先端科技有限公司；十二烷基硫酸钠（SDS）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、正己醇、正庚烷、氯化钾（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；8-苯氨基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid）（ANS）（纯度 95%）：百灵威科技有限公司；透析袋（D25 mm）：上海蓝剂生化试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

自动水分滴定仪（ZSD-2J）、高速台式离心机（TGL-16G）：上海安亭科学仪器有限公司；真空冷冻干燥机（LGJ-18C）：上海慕泓真空设备有限公司；荧光分光光度计（Cary Eclipse）：安捷伦有限公司；紫外分光光度计（UV-1901）：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 反胶束溶液中含水量（Wo）的测定

用Karl-fischer法[8]测定其“水池”的大小。

式中：Wo为反胶束溶液中增溶水和表面活性剂的摩尔比率。

1.3.2 样品蛋白质含量的测定

采用国家标准GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》。

1.3.3 不同Wo值DTAC反胶束溶液的配制

DTAC反胶束溶液是由表面活性剂DTAC、溶剂正庚烷及助溶剂正己醇构成的。正庚烷与正己醇体积比为4∶1，表面活性剂DTAC按照浓度为0.08 g/mL加入溶液中，摇床振荡（或磁力搅拌）使表面活性剂彻底溶解，得到澄清透明的溶液，加入一定量的pH值为7.0，KCl浓度为0.1 mol/l的磷酸二氢钾－磷酸氢二钠缓冲溶液，在振荡器中，恒温振荡150 min，溶液若为透明澄清，且底部没有分出水层，即为反胶束，否则，则不是，需重配。之后静置12 h。Wo值随着缓冲溶液量的改变而改变。配制Wo值分别为 15、20、30、35、40 的 DTAC 反胶束溶液备用。

1.3.4 萃取蛋白质样品的制备

1.3.4.1 蛋白质的前萃

豆粕粉按照0.025 g/mL的质量加入Wo为15、20、30、35、40的DTAC反胶束溶液中，萃取温度为35℃，恒温振荡器振荡萃取1 h，使之充分溶解；取出离心，转速3 500 r/min，离心15 min，萃取体系分为两层，上层为萃入蛋白质的反胶束层，下层为残渣，除去残渣，取出上层液准备用来后萃。

1.3.4.2 蛋白质的后萃

前萃液与1.0 mol/L KCl缓冲溶液等体积混合，向每组前萃液中加入适量的1.0 mol/L KCl缓冲溶液；35℃条件下，用恒温振荡器振荡80 min，溶解；取出离心，转速3 500 r/min，离心15 min，取下层液备用。

1.3.4.3 萃取蛋白质样品的制备

反胶束萃取的后萃液经过旋转蒸发浓缩后，采用分子量3 500道尔顿（Dalton，D）规格的透析袋处理24 h，然后冷冻真空干燥得到萃取后的蛋白质样品，备用。

1.3.5 乳化性的测定

蛋白质的乳化性包括乳化活性和乳化稳定性，采用乳化活性指数（Emulsifying Activity Index，EAI）和乳化稳定性指数（Emulsifying Stability Index，ESI）表示。乳化活性指数（EAI）和乳化稳定性指数（ESI）的测定方法参考 Lamlam Cheung[9]、Chen Chen[10]、Andrea K.Stone[11]等采用的方法。反胶束萃取各样品和大豆分离蛋白分别溶解于0.01mol/L pH7.0 Na2HPO4和KH2PO4缓冲溶液中配制成蛋白质浓度为2 g/L的溶液。将10 mL大豆色拉油和30 mL各样品蛋白液以及对照大豆分离蛋白液混合并在25℃，10 000 r/min的速度下均质搅拌1 min。在均质后0 min和10 min从容器底部吸取100 μL试样，并分别用0.1%的SDS溶液将其稀释100倍，采用1 cm比色皿，测定其在500 nm的吸光度，可得到A0和 A10。

式中：A0是0 min时的吸光度；A10是10 min时的吸光度；Δt=10 min。

式中：EAI为乳化活性，m2/g；N为稀释倍数；C为形成乳状液前水相中单位体积蛋白质的质量，g/mL；φ为乳化液中油的体积分数，此时为0.25。

1.3.6 表面疏水性的测定

不同Wo反胶束萃取的蛋白质和对照大豆分离蛋白的表面疏水性参照W.U.Wu等[12]所采用的方法。以8-苯氨基-1-萘磺酸（ANS）作为荧光探针，ANS采用0.01 mol/L pH7.0 Na2HPO4和KH2PO4缓冲溶液溶解，浓度为8 mmol/L。蛋白质样品分别配制成浓度为 0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.2、0.5 mg/mL溶液。激发波长为390 nm，发射波长为470 nm，狭缝宽度5 nm，不同浓度蛋白质溶液10 mL中加入50 μL ANS溶液，混匀立即测定样品溶液的荧光强度。以荧光强度对蛋白质浓度作标准曲线，蛋白质浓度不断减小，当蛋白质浓度无限趋近于0时，曲线该点的斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数（S0）。

1.3.7 蛋白质样品溶液內源荧光光谱扫描

反胶束萃取的蛋白质样品溶解于0.01 mol/L pH7.0 Na2HPO4和KH2PO4缓冲溶液中配制成浓度为0.5 mg/ml的溶液。分别测定激发波长280 nm和激发波长295 nm处扫描光谱。同时扫描Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步荧光光谱。

1.3.8 试验结果与统计

采用SPSS16.0软件对数据进行单因素分析和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 萃取蛋白质样品和大豆分离蛋白的蛋白质含量比较

萃取后的蛋白质样品和大豆分离蛋白的蛋白质含量如表1所示，Wo值越大，反胶束水池越大，萃取的大分子量蛋白质越多，萃取得到的样品蛋白质含量越高，反胶束萃取的样品蛋白质含量要比大豆分离蛋白稍高。

表1 萃取蛋白质与大豆分离蛋白的蛋白含量比较Table 1 The comparison of protein content between soy protein isolate and protein of reversed micellar extraction

2.2 DTAC反胶束含水量Wo对萃取蛋白质表面疏水性的影响

蛋白质的表面疏水性采用表面疏水性指数So的大小来表示。采用W.U.Wu，N.S[12]的试验方法测得的不同Wo萃取蛋白质产品表面疏水性曲线见图1。由图1中的曲线方程可得到DTAC反胶束含水量Wo对萃取蛋白质表面疏水性指数的影响见图2。

图1 Wo对萃取蛋白质表面疏水性的影响曲线Fig.1 The effect of Wo on surface hydrophobicity of protein extracted

图2 反胶束含水量Wo对萃取蛋白质表面疏水性指数的影响Fig.2 The effect of Wo of reverse micelles on surface hydrophobicity intex of protein extracted

Wo=15时，曲线方程为y=77.31x2+35.63x+12.55，R2=0.998；Wo=20时，曲线方程为y=122.5x2+50.57x+12.24，R2=0.999；Wo=30 时，曲线方程为y=-72.14x2+99.02x+11.76，R2=0.998；Wo=35 时，曲线方程为 y=-114.2x2+122.2x+12.17，R2=0.998；Wo=40时，曲线方程为y=-122.6x2+178.6x+11.33，R2=0.994。

由图2可见，随着DTAC反胶束含水量Wo值的增加，蛋白质的表面疏水性指数也逐渐增大。

2.3 DTAC反胶束含水量Wo对萃取蛋白质构象的影响

蛋白质的内源荧光主要来源于色氨酸（Try）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）残基。由于苯丙氨酸的量子产率很低，酪氨酸被电离或者接近氨基、羧基时其荧光几乎全部猝灭[13]。因此，通常利用Try的荧光来研究蛋白质分子的构象的变化。Sulkowska A[14]、Jiang M[15]，Liu Y等[16]认为激发波长为280 nm时，蛋白质的荧光来自于色氨酸和酪氨酸两者的贡献，但其中主要是色氨酸贡献，激发波长为295 nm时，蛋白质荧光完全来自于色氨酸。Miller等[17]研究发现，由Δλ=15 nm所作出的同步荧光光谱只显示酪氨酸残基的光谱特性；而由Δλ=60 nm的同步荧光光谱仅表现色氨酸残基的荧光。因氨基酸残基的最大吸收波长与其所处环境的极性有关，故而由发射波长的改变可判断蛋白质构象的变化。Brustein等[18]认为色氨酸的最大荧光发射峰位对环境很敏感，所处环境的疏水性逐渐增加，其最大发射波长蓝移。λmax位于342 nm左右时，色氨酸部分处在疏水性介质中。因此同步荧光光谱中最大荧光发射波长蓝移时，其所处环境的疏水性逐渐增大，说明蛋白质的构象发生了变化。

激发波长280 nm和激发波长295 nm的蛋白质荧光见图3和图4。图3为色氨酸和酪氨酸两者的荧光图谱，图4为蛋白质中色氨酸残基的荧光图谱。

图3 激发波长280 nm蛋白质荧光发射光谱Fig.3 Fluorescence emission spectra of protein at an excitation wavelength of 280 nm

图4 激发波长295 nm蛋白质荧光发射光谱Fig.4 Fluorescence emission spectra of protein at an excitation wavelength of 295 nm

DTAC反胶束不同含水量Wo萃取蛋白质样品的同步荧光光谱如图5、图6。图5为酪氨酸残基的的荧光，图6为色氨酸残基的荧光光谱。通过图5和图6可知色氨酸对蛋白质的荧光起主要贡献。

图5 0.5 mg/mL蛋白质溶液Δλ=15 nm的同步荧光图谱Fig.5 Synchronous fluorescence spectrum of protein concentration 0.5 mg/mL with Δλ=15 nm

图6 0.5 mg/mL蛋白质溶液Δλ=60 nm的同步荧光图谱Fig.6 Synchronous fluorescence spectrum of protein concentration 0.5 mg/mL with Δλ=60 nm

图4中荧光完全来自于色氨酸，色氨酸的荧光最大发射峰位于340 nm～349 nm之间。图6是蛋白质的同步荧光图谱，萃取蛋白质最大荧光发射峰λmax位于340 nm～343 nm之间。由此说明色氨酸残基部分处于疏水性介质中，部分位于亲水介质中。并且最大荧光峰有小的蓝移，说明其所处疏水性增大，蛋白质构象发生了变化。萃取蛋白质表面疏水性随着Wo增大而增大，暴露在蛋白质表面上的色氨酸残基会增多，因此随着Wo值的增大，色氨酸的荧光值也逐渐增加。

2.4 DTAC反胶束含水量Wo对萃取蛋白质乳化活性的影响机理

以大豆分离蛋白的乳化活性指数为对照，比较了不同Wo值DTAC反胶束萃取蛋白质产品的乳化活性指数差别见图7。

图7 反胶束含水量Wo对萃取蛋白质乳化活性的影响Fig.7 The effect of Wo of reverse micelles on emulsifying activity of protein extracted

由图7可见反胶束体系含水量Wo对提取蛋白质的乳化活性有一定的影响。在表面活性剂DTAC能形成反胶束体系的Wo范围内，随着Wo的增大，乳化活性逐步减小。与大豆分离蛋白的乳化活性相比，Wo为15和20时萃取的蛋白质乳化活性要稍高，Wo为30、35和40时萃取的蛋白质乳化活性要小于大豆分离蛋白的乳化活性。

蛋白质的乳化性质与蛋白质的溶解性有很大关系。一定条件下，溶解性的改善将会有利于蛋白质乳化性的提高。另外蛋白质的乳化性大小还取决于蛋白质分子中亲水、亲油基团以及它们所处的位置。因此蛋白质乳化性受分子量大小和构象影响比较大[19]。大豆蛋白质为球蛋白，在水溶液中溶解度非常小，而经过反胶束萃取的蛋白质溶解性高，分子量小于大豆分离蛋白，并且随着Wo的增加，大分子量蛋白质比例会有所增加[7]；蛋白质构象此时也发生了巨大的变化，疏水性氨基酸残基暴露在表面比例增加，将会导致亲水亲油的变化，蛋白质表面疏水性变大，影响蛋白质的乳化活性。由于这些因素，随着Wo的增大，萃取蛋白质乳化活性略有下降。

2.5 DTAC反胶束含水量Wo对萃取蛋白质乳化稳定性的影响

DTAC反胶束含水量Wo对萃取蛋白质乳化稳定性的影响见图8所示。

图8 反胶束含水量Wo对萃取蛋白质乳化稳定性的影响Fig.8 The effect of Wo of reverse micelles on emulsion stability of protein extracted

由图8可知，随着Wo值的增大，萃取蛋白质的乳化稳定性逐渐增加，Wo为15和20时萃取的蛋白质乳化性稳定性与大豆分离蛋白基本相似，而Wo为30、35和40时萃取的蛋白质乳化稳定性要远远大于大豆分离蛋白。影响蛋白质乳化稳定性的因素与乳化活性相似。蛋白质溶解性、蛋白质分子量、蛋白质构象的变化以及蛋白质表面疏水性都会影响乳化稳定性的变化。蛋白质分子量和构象的变化导致萃取蛋白质表面疏水性的增加，从而改善了蛋白质的表面活性特征，提高了体系的稳定性。

2.6 萃取的蛋白质表面疏水性与乳化活性和乳化稳定性相关性分析

不同含水量Wo值的DTAC反胶束体系萃取的蛋白质表面疏水性与乳化活性和乳化稳定性相关性见图9，经spss相关性分析见表2。由表2可以得出，萃取蛋白质的表面疏水性与乳化稳定性显著正相关（r=0.990，p＜0.01），表面疏水性与乳化活性显著负相关（r=-0.941，p＜0.05）。所以蛋白质的乳化活性和乳化稳定性与蛋白质的表面疏水性有很大的关系，能够影响蛋白质表面疏水性的因素都可能影响到蛋白质的乳化活性和乳化稳定性。

3 结论

本文系统研究了DTAC反胶束含水量Wo对萃取蛋白质乳化性的影响，探讨了影响的机理，萃取的蛋白质有较好的乳化性，在食品中有一定的应用价值。

图9 萃取的蛋白质表面疏水性与乳化活性和乳化稳定性相关性分析Fig.9 Correlations between surface hydrophobicity and emulsifying activity，emulsion stability of protein extracted

表2 相关性分析Table 2 Correlations analysis

随着DTAC反胶束体系含水量Wo值的增大，萃取蛋白质色氨酸残基荧光值逐渐增加，色氨酸残基部分处于疏水性介质中，蛋白质构象发生了变化。暴露在蛋白质表面上的色氨酸残基会增多，蛋白质表面疏水性也会随着Wo值的增加而增大。

DTAC反胶束含水量Wo对萃取蛋白质乳化活性和乳化稳定性有一定的影响，随着Wo值的增加，蛋白质的乳化活性略微下降，蛋白质的乳化稳定性显著提高，并且萃取蛋白质乳化稳定性远远大于大豆分离蛋白。

萃取蛋白质的表面疏水性与乳化活性和乳化稳定性有一定的相关性。萃取蛋白质的表面疏水性与乳化稳定性显著正相关（r=0.990，p<0.01），表面疏水性与乳化活性显著负相关（r=-0.941，p<0.05）。

[1]Kinsella JE.Functional properties of soy proteins[J].J Am Oil Chem Soc,1979,56(3):242-258

[2]黄友如,华欲飞,裘爱泳.大豆分离蛋白的功能性质及其影响因素[J].粮食与油脂,2003(5):12-16

[3]谢良,王璋,蔡宝玉.大豆分离蛋白的组成与功能性质[J].中国粮油学报,2000,25(6):6-11

[4]程翠林,石彦国,王振宇,等.大豆蛋白亚基组成对其功能特性的影响[J].食品科学,2006,27(3):70-75

[5]刘大川,杨国燕,翁利荣,等.超滤膜法与碱溶酸沉法制备大豆分离蛋白功能特性的比较[J].中国油脂,2003,(12):5-7

[6]田少君,孟永成,卢萍,等.两种不同工艺制备的大豆分离蛋白功能特性的比较[J].郑州工程学院学报,2004,25(4):16-19

[7]程小丽.同时分离大豆蛋白和油脂的反胶束体系研究[D].郑州:河南工业大学,2010

[8]黄伟坤.食品检验与分析[M].北京:轻工业出版社,1989

[9]Lamlam Cheung,Janitha Wanasundara,Michael T Nickerson.Effect of pH and NaCl on the Emulsifying Properties of a Napin Protein Isolate[J].Food Biophysics,2015(10):30-38

[10]Chen Chen,Yu-Jie Chi,Wei Xu.Comparisons on the Functional Properties and Antioxidant Activity of Spray-Dried and Freeze-Dried Egg White Protein Hydrolysate[J].Food Bioprocess Technol,2012(5):2342-2352

[11]Andrea K Stone,Nicole A Avarmenko,Tom D Warkentin.Functional Properties of Protein Isolates from Different Pea Cultivars[J].Food Sci Biotechnol,2015,24(3):827-833

[12]WU Wu,NS Hettiarachchy,M Qi.Hydrophobicity,Solubility,and Emulsifying Properties of Soy Protein Peptides Prepared by Papain Modification and Ultrafiltration[J].JAOCS,1998,75(7):845-850

[13]陶慰孙,李惟,姜涌明,等.蛋白质分子基础[M].北京:人民教育出版社,1982

[14]Sulkowska A,Równicka J,Bojko B,et al.Interaction of anticancer drugs with human and bovine serum albumin[J].J Mol Struct,2003,651-653:133-140

[15]Jiang M,Xie M X,Zheng D,et al.Spectroscopic studies on the interaction of cinnamic acid and its hydroxyl derivatives with human serum albumin[J].J Mol Struct,2004,692:71-80

[16]Liu Y,Xie M X,Jiang M,et al.Spectroscopic investigation of the interaction between human serum albumin and three organic acids[J].Spectrochim Acta A,2005,61:2245-2251

[17]Miller J N.Recent advances in molecular luminescence analysis[J].Proc Anal Div Chem Soc,1979,16:203-208

[18]Brustein E A,Vedenkina N S,Irkova M N.Fluorescence and the location of tryptophan residues in protein molecules[J].Photochem Photobiol,1973,18:263-279

[19]赵新淮.食品化学[M].北京:化学工业出版社,2006