小麦苗叶绿素在食品加工因素中的稳定性分析

2018-03-06张琛孙丰婷胡舰许慧卿

食品研究与开发 2018年5期

张琛，孙丰婷，胡舰，许慧卿，*

（1.扬州大学食品科学与工程学院，江苏扬州225127；2.江苏中谱检测有限公司，江苏南京210061）

小麦苗为禾本科植物小麦的嫩茎，在中医里有清热解毒、消炎、去臭、促进伤口愈合、抗氧化、预防肿瘤等生理作用，食用安全性极高[1-3]。此外，小麦苗含有丰富的叶绿素，其叶绿素原液在食品中常被做天然着色剂。但是，在实际生产加工中小麦苗叶绿素的含量和性质常常受到加工条件的影响而发生变化。目前，对于叶绿素护绿的研究，主要是通过将其转化成相应的铜盐、锌盐等，但这些方法只考虑对产品稳定性的增益，没有考虑铜、锌等离子作为人体必需微量元素其添加量对人体的影响[2-4]。本研究拟通过对小麦苗叶绿素在食品加工中稳定性的分析，为小麦苗叶绿素原液在生产实践中的利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

原料：新鲜小麦幼苗（六叶期）采自扬州市汊河镇。

HH-4型数显恒温水浴锅：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；SHB-IV双A型双面循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；FA1004B型电子天平、722N型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；MJP-250型霉菌培养箱：上海精宏实验设备有限公司。

乙醇、浓盐酸、氢氧化钠、亚硫酸钠：国药集团化学试剂有限公司；30%的双氧水：西陇化工股份有限公司；氯化铁、氯化亚铁：上海苏懿化学试剂有限公司；柠檬酸、蔗糖、谷氨酸钠：天津大茂化学试剂厂；加碘盐：江苏金桥制盐有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小麦苗叶绿素提取液制备

取新鲜干净的麦苗叶片7 g，加入少量碳酸钙，并研磨，同时滴加数滴90%乙醇；匀浆后转移至100 mL锥形瓶中，加90%的乙醇溶液140 mL，超声波破碎处理30 min，处理温度为50℃，超声波功率400 W[5-6]。静置冷却，减压抽滤，得到叶绿素提取液，保存于棕色密封瓶中。

1.2.2 小麦苗叶绿素稳定性试验

对叶绿素粗提液分装：取提取液2 mL加水稀释5倍，得叶绿素稀释液并置于50 mL的比色管中，待用。

1.2.2.1 氧化剂、还原剂对小麦苗叶绿素稳定性的影响

取稀释样液9份，分成3组，第1组分别加5、10、15 mL 的重馏水；第 2 组分别加 5、10、15 mL 30%的过氧化氢溶液；第3组分别加5、10、15 mL 1%的亚硫酸钠溶液。用90%乙醇溶液定容至25 mL，充分混合后避光静置30 min，在665 nm[8-9]波长处测定吸光度。

1.2.2.2 金属离子对小麦苗叶绿素稳定性的影响

取稀释样液并分组编号，分别加入浓度均为1 mol/L的氯化铁、氯化亚铁、2、4、6 mL。用乙醇定容至25 mL，充分混合后避光静置30 min，在665 nm测定吸光度。

1.2.2.3 酸、碱性对小麦苗叶绿素稳定性的影响

取稀释样液并分组编号，分别加入 1、2、3、4、5mL的3 mol/L盐酸溶液和3 mol/L氢氧化钠溶液。用乙醇定容至25 mL，充分混合后避光静置30 min，在665 nm测定吸光度。

1.2.2.4 食品添加剂对小麦苗叶绿素稳定性的影响

取稀释样液并分组编号，分别加入浓度均为1 mol/L的柠檬酸、蔗糖、食用碘盐、谷氨酸钠溶液5、10、15 mL，充分混合后避光静置30 min，在665 nm测定吸光度。

1.2.2.5 食品加工中温度对小麦苗叶绿素稳定性的影响

取稀释样液并分组编号，分别将每组置于常温（20 ℃）、50、70、80、90、100 ℃的水浴锅中水浴处理10 min，取出后迅速冷却，在665 nm测定吸光度。

1.2.2.6 光照在食品加工中对小麦苗叶绿素稳定性的影响

取稀释样液并分组编号，分别将每组置于黑暗处，太阳光照下，紫外线光照下，处理30 min～60 min后全部遮光，在665 nm测定吸光度。

1.2.2.7 食品贮藏时间对小麦苗叶绿素稳定性的影响

取稀释样液并分组编号，遮光常温密封保存，每隔5天测一次吸光度。

2 结果与分析

试验结果用吸光度平均值±标准误表示，或采用Origin7.5软件进行绘图；颜色变化与PANTONE色卡比对。

2.1 氧化剂、还原剂对小麦苗叶绿素稳定性的影响

分别以H2O2、Na2SO3为氧化剂、还原剂对小麦苗叶绿素进行作用，加入氧化剂后样液由明亮的绿色（PANTONE 348U）转变为黄色（PANTONE 115U），从低剂量到中剂量吸光度下降，高剂量组相对中低组吸光度有所上升；加入低剂量的还原剂样液无明显变化，高剂量的还原剂使样液由透亮的绿色（PANTONE 348U）转变为浑浊的绿色（PANTONE 353U），吸光度随之增大。测试结果如表1所示。

表1 氧化剂、还原剂对小麦苗叶绿素稳定性的影响Table 1 Influence of oxidize,reducing agent on stability of wheat seedling chlorophyll

与空白组相比，氧化剂、还原剂对小麦苗叶绿素稳定性起到了不同的作用；氧化剂有破坏作用，低剂量的氧化剂即可对样液的稳定性产生显著的破坏效果，且随浓度的增大破坏作用增强；还原剂有保护作用，中、低剂量的还原剂对样液的稳定性有显著的保护作用，但高剂量的还原剂对叶绿素的稳定性有显著的破坏作用；空白组中随着H2O的添加量增加，吸光度明显的下降；由于水的增加，降低了乙醇的浓度，进而使叶绿素的溶解度和浓度降低。

2.2 金属离子对小麦苗叶绿素稳定性的影响

通过定量添加FeCl2、FeCl3研究亚铁离子、铁离子对小麦苗叶绿素稳定性的影响，加入FeCl3后样液由翠绿色（PANTONE355U）变为黄褐色（PANTONE 7409U），加入FeCl2后样液颜色由深变浅，失去明亮的色泽。测试结果如表2所示。

Fe2+、Fe3+对叶绿素稳定性均有显著破坏作用，破坏作用与剂量高低呈正相关关系，且Fe3+的破坏力要强于Fe2+；叶绿素分子的中镁元素与4个吡咯环处于同一个平面上[1]，这种结构很不稳定，导致镁离子极易从叶绿素分子中央脱落，从而在溶液中和铁离子、亚铁离子发生置换反应，形成相对应的颜色。

2.3 酸、碱性对小麦苗叶绿素稳定性的影响

通过定量添加HCl、NaOH，研究加工介质的酸碱性对小麦苗叶绿素稳定性的影响，结果如表3所示。

表3 酸、碱性对小麦苗叶绿素稳定性的影响Table 3 Influence of acids and bases on stability of wheat seedling chlorophyll

分别滴加酸和碱溶液后样液吸光度都呈现出显著的下降。大体上吸光度的下降程度与酸、碱的浓度成正相关关系，且碱液浓度与吸光度的下降程度的相关性更为明显。酸和碱都对叶绿素的稳定性产生较大的影响，并且酸的影响要大于碱，酸使叶绿素溶液变成淡黄绿色（PANTONE 388U），碱使叶绿素溶液颜色色度下降并略有浑浊质感呈现出黄绿色（PANTONE 390U）。

2.4 食品添加剂对小麦苗叶绿素稳定性的影响

定量添加常见食品添加物（柠檬酸、蔗糖、加碘食盐、谷氨酸钠）研究添加量及时间对小麦苗叶绿素稳定性的影响，结果如表4所示。

表4 食品添加剂对小麦苗叶绿素稳定性的影响Table 4 Influence of food addities on stability of wheat seedling chlorophyll

加入柠檬酸后样液由翠绿色（PANTONE 348U）变为黄色（PANTONE 3955U），吸光度下降。加入蔗糖、加碘食盐、谷氨酸钠后样液的颜色基本没有变化。5 d后观察发现蔗糖组颜色仍是明亮的翠绿色其余组为黄色（PANTONE 3955U）或黄绿色（PAN－TONE 379U），所测得的吸光度可看出小麦苗叶绿素样液整体呈现下降趋势，其中蔗糖处理组吸光度下降程度明显小于另外3组。

2.5 食品加工中温度对小麦苗叶绿素稳定性的影响

根据试验结果绘制小麦苗叶绿素提取液的吸光度与食品加工温度之间的关系图，如图1所示。

图1 温度对小麦苗叶绿素稳定性的影响Fig.1 Influnence of temperature on stability of wheat seedling chlorophyll

由图1可知，小麦苗叶绿素样液在不同的加工温度下降解速度不同，在80℃附近出现明显的拐点，80℃之前降解速率比较缓慢，80℃之后降解速率加快，当温度达到90℃以上时叶绿素含量急速下降。

2.6 光照在食品加工中对小麦苗叶绿素稳定性的影响

分别以遮光、紫外线、复合光（太阳光）对样液进行处理，结果如表6所示。

表6 不同光照对小麦苗叶绿素稳定性的影响Table 6 Influence of different light on stability of wheat seedling chlorophyll

在避光处理过程中小麦苗叶绿素提取液基本不发生变化，在紫外线照射处理后小麦苗叶绿素样液颜色仍然为翠绿色但吸光度出现了明显的下降说明紫外线对小麦苗叶绿素有一定的降解作用。经复合光（太阳光）照射处理后小麦苗叶绿素样液由翠绿色变成了淡黄色（PANTONE 3945U），且吸光度急剧降低说明太阳光对离体的叶绿素有较强的破坏降解作用。这可能是因为叶绿素中多不饱和双键很不稳定。

2.7 食品贮藏时间对小麦苗叶绿素稳定性的影响

根据实验结果绘制小麦苗叶绿素提取液与贮藏时间之间的关系图，如图2所示。

图2 贮藏时间对小麦苗叶绿素稳定性的影响Fig.2 Influnence of storage time on stability of wheat seedling chlorophyll

随着贮藏时间的延长小麦苗叶绿素样液的吸光度逐渐降低，且初期下降快后期逐渐变缓。小麦苗叶绿素的含量随加工时间的延长而降低，降解速率随时间的延长而减缓。颜色变化是：明亮的绿色（PANTONE 348U）—橄榄绿（PANTONE 582U）—黄绿色（PANTONE 584U）—明亮的黄色（PANTONE 102U）。

3 讨论

H2O2具有氧化性，叶绿素分子中存在多不饱和双键，极易被氧化。加入中低剂量H2O2致使小麦苗叶绿素被氧化，但高剂量H2O2会在氧化作用的同时产生细微的气泡干扰吸光度造成吸光度值的增加。Na2SO3对植物多酚氧化酶具有强烈的抑制作用[7]，且Na2SO3具有还原性，还原性要强于叶绿素。少量的还原剂可以保护叶绿素，防止叶绿素被介质中的氧气、氧化酶氧化。过量的Na2SO3使溶液呈碱性，叶绿素与游离的OH-发生反应，使得提取液变浑浊，表现为吸光度增大。

在酸性环境中离体叶绿素中的镁原子被溶液中的氢替换，发生格林反应[8]，使得叶绿素样液由翠绿色变为淡黄绿色，同时吸光度下降。在碱性环境中叶绿素与氢氧化钠发生了皂化水解反应，生成了氢氧化镁、叶绿酸盐、叶绿醇等物质，使得叶绿素样液颜色变浅，表现为吸光度下降。

温度对叶绿素稳定性影响机理有两方面：一、温度升高叶绿素降解，高温促使降解速度加剧；二、较高温度加剧叶绿素卟啉环中心的Mg2+脱落引起褪色[9]。小麦苗原液中的叶绿素耐受温度在80℃附近，因此介质温度大于80℃后叶绿素稳定性急剧下降。谢宇奇等[4]研究中发现芒果叶叶绿素稳定性在80℃附近出现拐点，这与本试验结果一致。

在食品添加剂试验中，蔗糖在叶绿素粗提液中发生水解，水解产生的葡萄糖和果糖对叶绿素有一定的保护作用。由于柠檬酸为有机酸，叶绿素与有机酸发生反应，叶绿素空间结构被破坏故而更容易发生降解。蔗糖（及其水解物）、加碘食盐、谷氨酸钠相对分子较大、性质稳定，其溶液将叶绿素分子包裹，起到了一定的隔离保护作用。顾声音[10]在对竹叶叶绿素稳定性研究中也表明一定浓度的蔗糖溶液、味精溶液对叶绿素护绿有增益作用，可在本实验基础上进一步探究蔗糖对小麦苗叶绿素的最佳护绿浓度。

在光照下，活性氧往往可激活碳环的多不饱和双键而引起叶绿素环降解;而且自然光中可见光及红外线可以产生热量，提高温度，从而加速自由基等氧化性强的物质对叶绿素的破坏作用;同时长时间光照也会导致叶绿素光敏氧化，降解为无色产物，从而使叶绿素含量大幅度降低[11-13]。魏俊等[14]研究发现菠菜叶绿素对光照和紫外线照射都比较敏感，本试验结果则表明小麦苗叶绿素有较好的抗紫外线效果，这种差异可能是由于不同物种所含叶绿素的种类与比例不同。

样液叶绿素降解速率随贮藏时间的增加呈现出先快后缓的特点，这主要是由于降解的叶绿素分子并非完全分解，而是以叶绿素片段或部分结构而存在于样液中当小麦苗叶绿素样液降解到一定程度后，溶液中的叶绿素片段或部分结构接近饱和，使得叶绿素的有了重组的可能，进而产生了叶绿素的降解与重组的动态平衡。在施瑛等[15]的研究中表明小麦汁中含有大量黄酮类物质，且具较强的抗氧化作用。本实验材料是小麦苗粗提液，含有一定量的植物黄酮，样液由绿变黄至恒定的过程可能是叶绿素降解及植物黄酮抗氧化作用的综合结果。

4 结论

不同浓度的氧化剂、Fe3+、Fe2+、酸、碱、柠檬酸、加碘食盐、谷氨酸钠溶液以及80℃以上的温度、复合光照射，均会使小麦苗粗提液中的叶绿素含量降低；此外氧化剂、Fe3+、Fe2+、酸、柠檬酸、复合光照会使小麦苗叶绿素粗提液发生不良色变，使粗提液由明亮的绿色变为不同程度的黄色；而还原剂、碱、蔗糖、加碘食盐、谷氨酸钠溶液以及紫外线照射对粗提液的颜色变化影响较小；粗提液中叶绿素含量随贮藏时间呈现出先快后缓的降解趋势，但低剂量的还原剂、蔗糖溶液对小麦苗叶绿素粗提液有明显的护绿效果，此外小麦苗叶绿素表现出较强的抗紫外线效果。

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