6种热带水果多酚组成及其抗氧化活性分析

李晓乐，杨瑞丽，张玉莹，豆荣，李武，*

（1.海南大学食品学院，海南海口570100；2.广东省食品质量安全重点实验室/华南农业大学食品学院，广东广州510642）

多酚（polyphenols）是一类具有多酚羟基的化合物，其广泛地分布在水果、蔬菜和谷物中[1]，具有抗氧化、抗肿瘤、预防心脑血管疾病等活性作用[2-4]。天然存在的多酚以游离态和结合态两种形式存在于食物基质中，前者是水或极性溶剂可溶性酚类物质，后者是溶剂不能直接萃取而以酯键、糖苷键等形式与糖类或蛋白质等物质结合的酚类物质。目前对样品多酚含量的评价，主要是采用溶剂直接萃取后进行定量分析，此类方法可以反映样品中的游离酚含量，而不能对其中的结合酚进行分析[1]。最近的研究显示，多酚对健康的促进作用不仅与其游离酚有关，而且与其结合酚的含量与组成也密切相关[5-6]。研究表明，食物中不能被小肠消化吸收的结合酚，通过与结肠微生物的作用释放发挥生理活性作用[7-8]，结合态多酚逐渐成为多酚研究的热点。

在日常饮食中，果蔬是人体摄入多酚的主要来源之一。研究显示，由于日照和高温等生长环境特点，热带水果含有相对较高的多酚类物质。近年来，研究者对一些热带水果中的酚类物质、抗氧化活性进行了研究。Septembre等[9]比较了法国6种热带水果的抗氧化活性，分析了其多酚提取物对红细胞和脂肪细胞的保护作用。周晓敏等[10]分析了番石榴的酚类物质组成，发现番石榴主要含有没食子酸、儿茶素、槲皮素等酚类成分。但是对于热带水果游离酚和结合酚中单体酚的比较性分析还十分有限。本文对我国6种热带特色水果的游离酚、结合酚含量，单体酚组成以及其抗氧化活性进行了分析，旨在为我国热带水果的开发利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

番石榴（Psidium guajava Linn.珍珠，广东）、杨桃（Averrhoa carambola L.广东）、芒果（Mangifera indica L.大金煌芒，海南）、荔枝（Litchi chinensis Sonn.桂味，广东）、柠檬（Citrus limon（L.）Burm.f.广东）、龙眼（Dimocarpus longan Lour.储良，广东）：海南省海口市。

福林酚（Folin-cioaclteu）：国药集团化学试剂有限公司；2，2-联苯基-1-苦基肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl)hydrazyl，DPPH）：上海麦克林生化科技有限公司；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2，2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt，ABTS）：山东西亚化学工业有限公司；Trolox（水溶性维生素E）：东京化成工业株式会社；没食子酸、槲皮素、芦丁、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、高丁香酸、香草醛、对香豆酸、阿魏酸：成都瑞芬思生物科技有限公司（纯度＞98%）；甲醇、乙腈（色谱纯）：TEDIA 公司；其他试剂：广州化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

FSH-2A可调高速均质机：江苏常州国旺仪器制造有限公司；IKA-RV8旋转蒸发仪：德国IKA有限公司；723可见光分光光度计：上海奥谱勒有限公司；Agilent 1260高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 游离酚的提取

游离酚提取参照Wolfe等[11]的方法：挑选成熟度一致水果，自来水洗净后用蒸馏水冲洗一遍。取水果可食用部分，25 g（3个平行）加入100 mL预冷的80%丙酮，均质机均质提取6 min（3.0 min×2停顿30 s），纱布过滤，果渣复提1次，合并滤液，45℃真空浓缩后用蒸馏水定容至25 mL，-80℃冰箱保存待测。

1.3.2 结合酚的提取

结合酚的提取采用NaOH消化法，参照Lin等[12]的方法。将1.3.1中提取残渣用双蒸水除去有机试剂，加入 4 mol/L NaOH（1 g∶15 mL），室温磁力搅拌提取2.0 h后用4 mol/L盐酸调整pH值至2.0。乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，45℃旋转蒸发至干，用甲醇定容后储存于-80℃冰箱待测。

1.3.3 多酚含量的测定

参照Wolfe等[11]的方法，取125 μL稀释至一定浓度的提取物，加入0.5 mL去离子水和125 μL的Folin-Ciocalteu试剂，混匀后反应 6 min，再加入1.25 mL 7%Na2CO3溶液和1 mL蒸馏水，混匀，避光反应90 min后于760 nm测定其吸光值，空白使用125 μL溶剂代替提取物。结果以每100克新鲜果肉所含的没食子酸当量表示（mg GAE/100 g FW）。

1.3.4 单体酚类物质含量测定

单体酚色谱条件参照Subba等[13]方法并稍作修改，色谱柱型ZorbaxSB-C18（4.6mm×250mm，5.0μm）；流动相 A：0.4%冰醋酸，B：乙腈；流速 1.0 mL/min；柱温30℃；检测波长280 nm；梯度洗脱程序：0～40 min B 5%～35%；40 min～45 min ，B 35%～50%；45 min～50 min，B 50%～80%。进样量5.0 μL。将不同浓度的混标按照上述色谱条件进行分析，根据样品与标准品的保留时间定性，采用峰面积外标法进行定量。以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中目标物质含量。

1.3.5 水果提取物抗氧化活性

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

参照Ma等[14]的方法并略作修改，取0.2 mL稀释到一定浓度的样品，加入2 mL去离子和2 mL 0.2 mmol/L的DPPH自由基醇溶液，室温避光反应30 min后于517 nm处测定吸光度，空白用蒸馏水代替。结果以每100克鲜重中Trolox当量（μmol TE/100 g FW）表示结果。

1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力

采用张金宏[15]的方法。配制7.0 mmol/L ABTS储备液，140 mmol/L K2S2O8溶液。取5 mL 7 mmol/L ABTS溶液与88 μL 140 mmol/L K2S2O8溶液于离心管中，混匀，室温下避光反应12 h即为ABTS工作液（现配现用），将ABTS工作液在734 nm处的吸光度用无水乙醇调整到0.700±0.020后备用。取25 μL稀释至一定浓度的样品加入2 mL ABTS工作液，混匀后室温避光反应6 min，于734 nm处测定吸光值。结果以每100克鲜重中Trolox当量（μmol TE/100 g FW）表示。

1.3.6 统计分析

数据结果以平均值±标准差表示，实验数据的显著性检验运用DPS统计软件的ANOVA（以p＜0.05为差异显著）进行分析。

2 结果与分析

2.1 游离酚与结合酚含量

游离酚与结合酚含量见图1。

6种水果提取物中的游离酚如图1（a）所示，不同的水果之间多酚的含量差异较大，变异系数为74.32%。其中游离酚含量由高到低依次为杨桃[（342.85±8.38）mgGAE/100 g FW]、番石榴[（282.69±1.41）mg GAE/100 g FW]、荔枝[（91.82±2.09）mg GAE/100 g FW]、柠檬[（88.00±1.67）mg GAE/100 g FW]、龙眼[（85.13±0.51）mg GAE/100 g FW]、芒果[（36.20±0.37）mg GAE/100 g FW]。其中杨桃的游离酚含量是芒果的9.47倍。

图1 6种热带水果的游离酚和结合酚含量Fig.1 Free and bound phenolics content in six tropical fruits

6种水果结合酚[图1（b）]由高到低依次为杨桃[（23.19±2.52）mg GAE/100 g FW]、番石榴[（16.42±1.19）mg GAE/100 g FW]、荔枝[（3.82±0.99）mg GAE/100 g FW]、龙眼[（1.16±0.29）mg GAE/100 g FW]、柠檬[（0.92±0.06）mg GAE/100 g FW]、芒果[（0.80±0.10）mg GAE/100 g FW]，杨桃与番石榴显著高于其他 4 种水果（p＜0.05），荔枝、龙眼、柠檬、芒果结合酚含量无显著差异（p＞0.05）。

本文杨桃游离酚的含量与李群梅等报道[16]的不同品种杨桃游离酚含量（285 mg GAE/100 g FW～672 mg GAE/100 g FW）相当，结合酚的含量略高于Pang等的报道[17]（6.4 mg GAE/100 g FW～19.7 mg GAE/100 g FW）。荔枝游离酚和结合酚的含量低于Su等的报道[18]。番石榴游离酚的含量高于李武等的报道[（192.46±6.17）mg GAE/100 g FW][19]。芒果和柠檬的游离酚含量略低于早期的报道[19-20]，目前未见芒果和柠檬结合酚含量的报道。早期的研究发现，水果的产地、品种对其多酚含量具有显著的影响[20]。本文水果多酚的含量与文献报道存在一定差异，可能与提取溶剂、水果的产地、品种等因素有关。

2.2 单体酚组成分析

6种热带水果游离酚的组成和含量如表1所示。结果显示，番石榴主要含有鞣花酸、没食子酸和苯甲酸；杨桃主要含有芦丁、苯甲酸和鞣花酸，荔枝主要含有没食子酸和芦丁，龙眼主要含有没食子酸和高香草酸，柠檬主要含有芦丁、高香草酸、没食子酸和香草酸。其中，杨桃的苯甲酸、鞣花酸和阿魏酸的含量显著高于其他5种水果；龙眼的没食子酸的含量显著高于其他5种水果；柠檬的芦丁、高香草酸和香草酸的含量相对较高。

表1 6种水果游离酚中主要单体酚组成与含量Table 1 Quantification of the individual free phenolics in six fruits mg/100 g FW

本文番石榴、杨桃和荔枝单体酚组成和含量的结果与其他研究者的报道相近[17-18,21-22]。对比前期的报道[21,23]，本文首次在龙眼中检测到丁香酸；在芒果中检测到对香豆酸和香草酸。

6种热带水果结合酚的组成和含量如表2所示。番石榴结合酚中主要含有芦丁、鞣花酸、苯甲酸和香草酸，且均显著高于其他5种水果（p＜0.05）。与游离酚相比，番石榴结合酚中的香草酸、对香豆酸、芦丁的含量增加了3.47倍～8.00倍；杨桃结合酚中的原儿茶酸的含量增加了4.39倍，且显著高于其他5种水果（p＜0.05）。与游离酚相比，在4种水果的结合酚中检测到新的酚类组分，荔枝中检测到槲皮素和苯甲酸；龙眼中检测到苯甲酸；芒果中检测到鞣花酸；柠檬中检测到对香豆酸和鞣花酸。本文荔枝槲皮素含量的结果与Su等的报道[18]相一致，对其他5种水果结合酚的组成还鲜有报道。

表2 6种水果结合酚中主要单体酚组成与含量Table 2 Quantification of the individual bound phenolics in six fruits mg/100 g FW

2.3 抗氧化能力

6种水果游离酚与结合酚提取物的清除DPPH自由基清除能力见图2。

图2 6种水果游离酚与结合酚提取物的清除DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of free and bound phenolic extracted from six fruits

如图2（a）所示，6种水果游离酚提取物的DPPH自由基抗氧化值的变幅在261.07μmolTE/100gFW至3561.12μmolTE/100gFW之间，变异系数为104.81%。由高到低依次为杨桃（3 561.12±26.59）μmol TE/100 g FW、番石榴（3 471.72±25.17）μmol TE/100 g FW、荔枝（492.05±7.13）μmol TE/100 g FW、柠檬（375.07±11.03）μmol TE/100 g FW、龙眼（345.01±1.27）μmol TE/100 g FW、芒果（261.07± 2.72）μmol TE/100 g FW。其中，最高杨桃的DPPH自由基抗氧化值是芒果的13.64倍，柠檬与龙眼的抗氧化值无显著性差异（p＞0.05）。

6种水果结合酚[如图2（b）]提取物的DPPH自由基抗氧化值由高到低依次为杨桃（110.90±1.88）μmol TE/100 g FW、番石榴（61.08±2.46）μmol TE/100 g FW、荔枝（17.42±2.15）μmol TE/100 g FW、龙眼（6.34±1.14）μmolTE/100gFW、柠檬（4.59±1.22）μmol TE/100 g FW、芒果（4.59±0.24）μmol TE/100 g FW。其中，最高杨桃的DPPH自由基抗氧化值是最低芒果的24.16倍。

6种水果游离与结合酚提取物的清除ABTS+自由基能力见图3。

图3 6种水果游离与结合酚提取物的清除ABTS+自由基能力Fig.3 ABTS+radical scavenging activity of free and bound phenolics extracted from six fruits

如图3（a）所示，6种水果游离酚提取物的ABTS+自由基抗氧化值抗氧化值的变幅在48.74 μmol TE/100 g FW至240.72 μmol TE/100 g FW之间，变异系数为64.96%。由高到低依次为杨桃（240.72±10.21）μmol TE/100 g FW、番石榴（217.39±1.57）μmol TE/100 g FW、荔枝（87.50±6.16）μmol TE/100 g FW、龙眼（80.29±2.12）μmol TE/100 g FW、芒果（48.91±6.28）μmol TE/100 g FW、柠檬（48.74±1.02）μmol TE/100 g FW。其中，荔枝与龙眼以及芒果与柠檬之间无显著差异（p＞0.05）。

如图3（b）所示，结合酚提取物的ABTS+自由基抗氧化值由高到低依次为杨桃（135.87±1.81）μmol TE/100 g FW、番石榴（93.87±6.68）μmol TE/100 g FW、荔枝（19.75±3.67）μmol TE/100 g FW、龙眼（5.66±1.48）μmol TE/100 g FW、芒果（4.83±0.12）μmol TE/100 g FW、柠檬（2.22±0.07）μmol TE/100 g FW。

比较两种抗氧化测定方法的结果显示，龙眼、芒果和柠檬抗氧化活性的相对强弱在不同测定方法中存在一定的差异，这一结果与赵谋明等的报道[21]相一致。多酚提取物的抗氧化活性在不同测定方法中呈现的差异性，可能与方法的测定原理以及样品所含酚类物质的组成不同有关[24-25]。

3 结论

6种水果的游离酚含量为36.20 mg GAE/100 g FW～342.85 mg GAE/100 g FW，结合酚的含量为0.80 mg GAE/100 g FW～23.19 mg GAE/100 g FW；杨桃游离酚主要含有芦丁[（8.74±0.90）mg/100 g FW]、苯甲酸[（6.63±0.48）mg/100 g FW]、鞣花酸[（4.47±0.10）mg/100 g FW]，结合酚主要含有原儿茶酸[（3.07±0.50）mg/100 g FW]；番石榴游离酚主要含有鞣花酸[（1.57±0.30）mg/100 g FW]、没食子酸[（1.53±0.42）mg/100gFW]、苯甲酸[（1.39±0.10）mg/100gFW]，结合酚主要含有鞣花酸[（1.69±0.14）mg/100 g FW]、苯甲酸[（1.44±0.10）mg/100 g FW]、香草酸[（1.44±0.13）mg/100 g FW]；荔枝游离酚主要含有没食子酸[（5.18±0.04）mg/100gFW]、芦丁[（3.09±0.72）mg/100gFW]，结合酚主要含有原儿茶酸[（0.39±0.15）mg/100gFW]；龙眼游离酚主要含有没食子酸[（10.71±0.37）mg/100 g FW]、高香草酸[（2.04±0.01）mg/100 g FW]，结合酚主要含有鞣花酸[（0.44±0.03）mg/100 g FW]；柠檬游离酚主要含有芦丁[（9.34±0.43）mg/100 g FW]、高香草酸[（6.65±0.35）mg/100g FW]、没食子酸[（6.29±0.20）mg/100 g FW]；芒果游离酚主要含有没食子酸[（3.23±0.63）mg/100 g FW]、苯甲酸[（1.45±0.47）mg/100 g FW]，结合酚主要含有鞣花酸[（0.16±0.01）mg/100gFW]。6种水果游离酚和结合酚的DPPH自由基清除能力分别为261.07 μmol TE/100 g FW～3561.12μmolTE/100gFW 和 4.59 μmolTE/100gFW～110.90μmolTE/100gFW；ABTS+自由基清除能力分别为 48.74 μmolTE/100gFW～240.72μmolTE/100gFW和2.22μmolTE/100gFW～135.87μmolTE/100gFW。

[1]颜才植,叶发银,赵国华.食品中多酚形态的研究进展[J].食品科学,2015,36(15):249-354

[2]Cirillo G,Curcio M,Vittorio O.Polyphenol Conjugates and Human Health:A Perspective Review[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2016,56(2):326-337

[3]Burton-Freeman BM,Sandhu AK,Edirisinghe I.Red Raspberries an d Their Bioactive Polyphenols:Cardiometabolic and Neuronal Health Links[J].Advances in Nutrition,2016,7(1):44-65

[4]Mileo AM,Miccadei S.Polyphenols as Modulator of Oxidative Stress in Cancer Disease:New Therapeutic Strategies[J].Oxidative Medicine and Cellular Longevity,2016,2016(7):6475624-6475642

[5]Liyana-Pathirana CM,Shahidi F.Importance of Insoluble-bound Phenolics to Antioxidant Properties of Wheat[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(4):1256-1264

[6]Chandrasekara A,Shahidi F.Content of Insoluble Bound Phenolics in Millets and Their Contribution to Antioxidant Capacity[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010,58(11):6706-6714

[7]Ozdal T,Sela DA,Xiao Jianbo.The Reciprocal Interactions Between Polyphenols and Gut Microbiota and Effects on Bioaccessibility[J].Nutrients,2016,8(2):1-36

[8]Williamson G,Clifford MN.Colonic Metabolites of Berry Polyphenols:the Missing Link to Biological Activity[J].British Journal of Nutrition,2010,104(3):S48-S66

[9]Septembre-Malaterre A,Stanislas G,Douraguia E,et al.Evaluation of nutritional and antioxidant properties of the tropical fruits banana,litchi,mango,papaya,passion fruit and pineapple cultivated in Réunion French Island[J].Food Chemistry,2016,212:225-233

[10]周晓敏,付丽,卢文青,等.三种热带水果多酚物质的检测及其体外抗菌活性测定[J].中国热带医学,2017,17(1):36-40

[11]Wolfe K,Wu X,Liu R H.Antioxidant activity of apple peels[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,2003,51(3):609-614

[12]Lin X,Zhou L,Li T,et al.Phenolic content,antioxidant and antiproliferative activities of six varieties of white sesame seeds(Sesamum indicum L.)[J].Rsc Advances,2017(10):5751-5758

[13]Subba Rao M V,Muralikrishna G.Evaluation of the antioxidant properties of free and bound phenolic acids from native and malted finger millet(ragi,Eleusine coracana Indaf-15).[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,2002,50(4):889-892

[14]Ma X,Wua H,Liua L,et al.Polyphenolic compounds and antioxidant properties in mango fruits[J].Scientia Horticulturae,2011,129(1):102-107

[15]张金宏.苹果渣中游离酚和结合酚的提取及其功能特性的研究[D].咸阳:西北农林科技大学,2016:21-22

[16]李群梅.杨桃果实多酚及其抗氧化活性的研究[D].南宁:广西大学,2010:30-44

[17]Pang D,You L,Li T,et al.Phenolic profiles and chemical-or cellbased antioxidant activities of four star fruit(Averrhoa carambola)cultivars[J].Rsc Advances,2016,6(93):90646-90653

[18]Su D,Zhang R,Hou F,et al.Comparison of the free and bound phenolic profiles and cellular antioxidant activities of litchi pulp extracts from different solvents[J].BMC Complementary and Alternative Medicine,2014,14(1):9-20

[19]李武,李艳君,杨瑞丽.热带水果多酚提取物的抗氧化和抗增殖活性研究[J].现代食品科技,2013(10):2383-2387

[20]陈冠林,陈松根,赵颖莹,等.33种水果的总酚含量及其抗氧化能力研究[J].食品工业,2014(9):264-268

[21]赵谋明,董红竹,林恋竹.八种水果多酚定量分析与抗氧化活性研究[J].现代食品科技,2017(10):1-12

[22]Zhang R,Zeng Q,Deng Y,et al.Phenolic profiles and antioxidant activity of litchi pulp of different cultivars cultivated in Southern China.[J].Food Chemistry,2013,136(3-4):1169-1176

[23]石骏,廖森泰,张名位,等.干制加工对龙眼果肉多酚组成及抗氧化活性的影响[J].华南师范大学学报(自然科学版),2011(4):111-115

[24]杨瑞丽,陆俊丰,高歌,等.不同方法测定40种常见果蔬抗氧化活性的比较研究[J].广东农业科学,2011,38(8):72-74