玉屏风散加味方对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道炎症微环境的影响

卫 娜，王晓晓，王映棋，李 宁，程 羽，田守征，袁嘉丽

(云南中医学院，云南 昆明 650500)

近年来，由于雾霾等大气污染越来越严重，呼吸系统疾病的发病率逐年上升，预计到2020年慢性阻塞性肺疾病(COPD)将上升至全球致死病因第三位、疾病经济负担第五位[1]。气道炎症和气道重塑是COPD的基本病理特征之一，气道炎症既是COPD发病的主要原因，同时也是造成气流受限和气道重塑的重要原因。COPD气道炎症反应过程中的炎症细胞、炎症递质、气道的定植菌、气道局部黏膜免疫分子、受损的细胞器以及细胞代谢产物等构成了气道炎症微环境。当病原微生物等进入机体时，会刺激机体产生相应的防御反应，招募并活化多种炎症细胞和炎症递质聚集在气道局部[2]，气道局部微环境平衡被打破，当机体这种防御反应不能消除病原微生物时，就会发展成慢性气道炎症[3]，进一步损伤气道结构细胞，导致气道壁损伤和修复反复进行，最终形成气道重塑。可见，气道局部微环境失衡对于COPD的发生发展有着重要影响。玉屏风散加味方是云南省名中医李庆生教授的临床验方，该方紧扣COPD本虚标实的基本病机而选方用药，对于气道重塑相关因子MMP-9、TIMP-1、TGF-β1均有调节作用[4]。本研究进一步探讨了玉屏风散加味方对气道炎症微环境中分泌型免疫球蛋白A(SIgA)、多聚免疫球蛋白受体分泌片(SC)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)的影响，旨在为该方治疗COPD提供实验依据。

1 实验资料

1.1实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠36只，体质量180～220 g，由四川省达硕生物研究所提供，合格证号：0018491；许可证号：SCXK(川)2013-24。

1.2试剂及仪器 脂多糖(LPS，美国Simga公司生产，规格：10 mg/支)，红塔山牌香烟[84 mm烤烟型香烟，红塔烟草(集团)有限责任公司]，大鼠SIgA、SC、TNF-α、IL-8酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司)。自制有机玻璃烟熏箱(50 cm×40 cm×30 cm)，电热恒温干燥箱(湖北省黄石市医疗器械厂)，YP型电子天平(上海光正医疗器械有限公司)，FA1204C型电子天平(常州科源电子仪器有限公司)，石蜡切片机(Leica RM2245，德国徕卡)，摊片机(Leica HI1210, 德国徕卡)，烘片机(Leica HI1220，德国徕卡)，台式高速冷冻离心机(H1850R，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，显微镜(Cl/Ds-Fi型，日本尼康)。

1.3药物及制备 玉屏风散加味方：黄芪30 g、白术20 g、防风10 g、桑白皮15 g、浙贝母15 g、白芥子15 g、三七9 g、莪术15 g。根据生药与浸膏的比值，按照成人临床服药浓度换算为大鼠给药浓度，每只大鼠每日需给全方生药量17.2 g/kg为高剂量，低、中、高剂量比按1∶2∶4计算[5]。罗红霉素胶囊(江苏联环药业股份有限公司生产，生产批号：20150802)成人临床一日服药量为300 mg，根据中药给药方法计算出每只大鼠每日所需给药量为0.04 g/kg，给药前用0.9%氯化钠溶液制备成混悬液。

1.4实验动物分组、造模及干预 将上述大鼠随机分为正常组、模型组、罗红霉素组、玉屏风散加味方低剂量组、玉屏风散加味方中剂量组、玉屏风散加味方高剂量组，每组6只。实验开始前先适应性观察1周。正常组于第1，14天在10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉下气管内注入生理盐水200 μL，其余时间正常饲养。其余组参照文献[6]方法采用大鼠气管内注入LPS和持续被动烟熏刺激的方法复制COPD大鼠模型，即分别于第1，14天在10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉下气管内注入脂多糖200 μL,第2—13天和第15—56天上午将大鼠置入自制密闭有机玻璃箱内进行香烟烟熏，30 min/d。实验造模周期共8周，模型成功后给予大鼠继续隔天烟熏刺激8周，实验第17周开始各给药组给予相应剂量药物灌胃，正常组和模型组给予生理盐水灌胃，共灌胃28 d。

1.5检测指标及方法 末次灌胃24 h后处死各组大鼠，取大鼠一侧肺组织做病理切片，苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理学变化。取大鼠另一侧肺组织400 mg用冰冷的生理盐水冲洗去除血液，滤纸拭干，在研磨钵中倒入液氮预冷，将拭干后的肺组织放入研磨钵中，加入液氮，研磨。将研碎的肺组织倒入EP管中，加入1 mL磷酸缓冲盐溶液(pH 7.4)，用低温离心机(3 000 r/min)离心20 min，取上清液，用酶联免疫吸附(ELISA)法检测大鼠肺组织匀浆中SIgA、SC、TNF-α、IL-8的表达水平。

2 结 果

2.1各组大鼠肺组织病理切片表现 正常组大鼠肺组织形态结构正常，支气管上皮完整，纤毛结构完整、排列整齐，气管、血管周围无明显炎症反应，肺泡结构正常，腔内无明显渗出物，见图1。模型组大鼠气管上皮脱落、充血，可见肺大泡，肺内细支气管上皮增生、管腔变窄、管壁增厚，管壁及肺间质周围可见炎性细胞浸润，见图2。罗红霉素组大鼠肺内细支气管周围炎性细胞较模型组减少，肺泡间隔增宽，见图3。玉屏风散加味方各组大鼠肺内细支气管上皮增生不明显，管壁及肺间质周围炎性细胞浸润不明显，可见肺大泡，细支气管管腔狭窄及间质炎性细胞浸润等情况较模型组明显改善，且高剂量组改善更明显，见图4～6。

图1 正常组大鼠肺组织病理切片表现(10×10)

图2 模型组大鼠肺组织病理切片表现(10×10)

图3 罗红霉素组大鼠肺组织病理切片表现(10×10)

2.2各组大鼠肺组织中SIgA、SC、TNF-α、IL-8表达水平 模型组大鼠肺组织中SIgA、IL-8 SC表达水平与正常组比较差异均无统计学意义(P均>>0.05)，TNF-α表达水平明显高于正常组(P<0.05)。玉屏风散加味方低剂量组SIgA表达水平和玉屏风散加味方中、低剂量组SC表达水平均明显高于模型组(P均<0.05)，玉屏风散加味方高、低剂量组TNF-α表达水平明显低于模型组(P均<0.05)；玉屏风散加味方高、中剂量组SIgA表达水平和玉屏风散加味方高剂量组SC表达水平、玉屏风散加味方中剂量组TNF-α表达水平、玉屏风散加味方各剂量组IL-8表达水平与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

图4 玉屏风散加味方高剂量组大鼠肺组织病理切片表现(10×10)

图5 玉屏风散加味方中剂量组大鼠肺组织病理切片表现(10×10)

图6 玉屏风散加味方低剂量组大鼠肺组织病理切片表现(10×10)

3 讨 论

表1 各组大鼠肺组织中SIgA、SC、TNF-α、IL-8表达水平比较

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

COPD属于中医“咳嗽”“肺胀”“喘证”等范畴[7]，基本病机是本虚标实，肺气虚是该病的始发和根本原因[8]，痰浊、血瘀、水饮互结为标。COPD气道炎症反应实质上是气道局部微环境失衡的一种表现。李庆生教授提出“中医邪正发病学说与现代医学的免疫及微生态平衡观具有一致性”，并且认为正常的免疫功能及微生态平衡属于“正气”范畴，微生态失调与免疫功能低下或紊乱属于“邪气”范畴，因而在治疗疾病时应注重调整失调状态，补其不足、泻其有余，恢复机体内部及与外环境的相对平衡协调[9-11]。玉屏风散加味方以“益气扶正”经典方药玉屏风散为基础，配伍涤痰散结之桑白皮、浙贝母、白芥子，逐瘀散结之三七、莪术，通过“益气扶正祛邪”调节气道炎症微环境，恢复局部微环境平衡，从而减轻气道炎症反应，延缓气道重塑的发展。

呼吸道黏膜免疫系统作为黏膜免疫系统的重要组成部分，是保护呼吸道对抗外来有害物质侵袭的第一层防护墙。SIgA是呼吸道黏膜分泌的主要抗体，由J链连接2个单体IgA和分泌片SC组成，能保护黏膜防止细菌和病毒等黏附在黏膜表面，而被pIgR转运至细胞内的IgA可以中和病毒的复制[12]。研究发现，当呼吸道黏膜中分泌的SIgA水平降低时，机体患上呼吸道感染的概率较大，SIgA水平与机体对抗上呼吸道感染的能力有直接关系[13]。IL-8是一种炎性递质，能激活并趋化中性粒细胞，促使其脱颗粒和释放弹性蛋白酶等物质损伤气道[14]，目前在COPD急性期和稳定期患者的血清中均发现IL-8表达水平明显高于正常对照组[15-16]，提示IL-8参与COPD发生发展。TNF-α是一种主要由单核细胞和巨噬细胞产生的促炎因子，除了能激活白细胞启动炎症反应外，还能通过诱导气道黏液细胞的化生和高分泌、气道上皮细胞TNF-α和IL-8等受体的表达，从而参与上皮细胞的损伤和肺气肿；并且TNF-α还可以诱导中性粒细胞等生成IL-8，进一步加剧气道炎症[17]。

本实验结果显示，玉屏风散加味方各组大鼠肺组织病理情况较模型组有明显改善，且高剂量组改善效果更明显；模型组大鼠SIgA表达水平有低于正常组的趋势(无统计学差异可能是由于样本量较小所致)，这与张继华等[18]的研究结果相符；模型组大鼠IL-8表达水平有低于正常组的趋势，笔者推测或许是在复制大鼠模型时刺激了IL-8上游或是下游的某些机制而造成的，具体原因有待探索；模型组SC表达水平有高于正常组的趋势，笔者推测其原因可能是受TNF-ɑ表达水平升高所影响。有研究显示，TNF-α可通过诱导转录因子IRF-1的合成而影响pIgR的表达，当TNF-ɑ浓度增高时，pIgR mRNA的表达水平随之升高[19]，具体原因有待后期进一步实验探索。玉屏风散加味方低剂量组SIgA表达水平和玉屏风散加味方中、低剂量组SC表达水平均明显高于模型组，玉屏风散加味方高、低剂量组TNF-α表达水平明显低于模型组，玉屏风散加味方高、中剂量组SIgA表达水平和玉屏风散加味方高剂量组SC表达水平、玉屏风散加味方中剂量组TNF-α表达水平、玉屏风散加味方各剂量组IL-8表达水平与模型组比较差异均无统计学意义。提示玉屏风散加味方可以增强或恢复机体正常免疫防御功能，从而减轻气道炎症。

综上所述，玉屏风散加味方可改善COPD模型大鼠肺组织病理形态，增强SIgA和SC的表达，降低TNF-α和IL-8的表达，提示该方药可干预COPD气道炎症微环境，增强机体局部黏膜免疫功能，减轻炎症反应。

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