鱼腥草素钠对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺组织PI3K、AKT1及mTOR mRNA表达的影响

吴中华，闫玲玲，杨爱东*，张海英，符胜光，杨云翔

(1. 上海中医药大学,上海 201203； 2. 上海市位育中学, 上海 200231)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) 是以肺部和气道慢性炎症反应为特征的疾病。近年来 COPD发病率呈持续增长趋势，据世界卫生组织预测，到2020年COPD将成为第三位死亡原因[1]。研究发现，在气道慢性炎性疾病中磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3- kinase，PI3K) /丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT) 信号通路可通过调控炎症细胞活化、炎性介质释放等途径发挥作用[2]，因此干预PI3K/AKT 信号通路中信号分子对防治COPD 发生发展有重要意义。我们既往研究表明加味小青龙汤(由小青龙汤加鱼腥草等中药组成)对 COPD大鼠肺组织有保护作用，其机理与该方下调TLR4蛋白和MyD88 mRNA表达、下调TNF-α和白介素-1β含量、下调NF-κB蛋白表达有关[3-4]。在此基础上本项目观察鱼腥草素钠对COPD大鼠肺组织PI3K、AKT1和mTOR (mammalian target of rapamycin, mTOR) mRNA表达的影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级Wistar雄性大鼠24只，鼠龄12周，体重(220±20)g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。专用标准颗粒饲料、水喂养。实验在上海中医药大学实验动物中心设施内进行【SYXK(沪)2014-0008】。所有的操作均按照上海中医药大学动物实验伦理委员会要求进行，本实验研究实验伦理委员会批准编号：2012015。

1.1.2 主要设备与仪器

低温冷冻离心机3K15, Sigma (美国)；生物安全柜TYPE B2, Sigma (美国)； BH2显微镜(Olympus(日本)；Real-time检测仪(7300 Sequence Detection System), ABI-7300 ABI(美国)；自制烟熏箱：宽30 cm，高40 cm，长60 cm有机透明储物箱。

1.1.3 试剂和药物

LPS冻干粉剂(O111:B4)购自美国Sigma公司，批号L1430；香烟：白沙烟(白盒，软包)，产商为湖南中烟工业有限责任公司，烟气烟碱量：1.0 mg，焦油：12 mg,一氧化碳：14 mg；引物和探针序列。PI3K：上游：5’-CGTGGGAGTACGTGAAACCT-3’，下游： 5’- CTGCTTTTGGGAGAGTCTGG-3’； AKT1：上游：5’-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3’，下游: 5’-TTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3’；mTOR：上游：5’-AGGAAGGACGTTTGCTCAGA-3’，下游：5’-TCCCTCACTGAACACAGCAG-3’；Actin:上游物:5’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’,下游引物：5’-ACCCTCATAGATGGGCACAG-3’， 5’端FAM修饰；3’端Tamra修饰；Trizol总RNA提取试剂、反转录和PCR扩增所需的酶及其他试剂均购自美国Invitrogen公司。

鱼腥草素钠购自上海青平药业有限公司，分子式: C12H23NaO5S，分子量: 302.36；地塞米松购自上海信谊药厂有限公司, 批号01120302。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型建立的方法以及分组、给药

按随机分组原则将大鼠分为正常组、模型组、地塞米松组和鱼腥草素钠组,每组6只。参照文献方法并加以改良建立COPD大鼠模型[5]。于实验开始第1、14天给予气管内滴注脂多糖,剂量为2 mg/kg。分别于第2～13天及第15～28天，每日同一时间将大鼠置于72 L (宽30 cm，高40 cm，长60 cm) 自制有机透明储物箱内，进行香烟烟雾暴露1次，每次10支，每次0.5 h。暴露方法为：将点燃的白沙牌香烟通过悬挂方法，将烟雾注入自制箱内。正常组用生理盐水进行气管滴注并在自制箱内吸入正常空气。在第2～13天、第15～28天，鱼腥草素钠组给予大鼠灌服鱼腥草素钠溶液(24.3 mg/kg)，地塞米松组通过胃灌服剂量为0.2 mg/kg，正常组、模型组在相应时点服灌等体积蒸馏水。各组动物用药量按人与动物的体表面积换算[6]。在实验建模期间观察大鼠活动、进食、饮水等基本生命活动情况。

注：A. 正常组； B.模型组； C. 地塞米松组；D. 鱼腥草素钠组。图1 各大鼠肺组织病理变化比较 (×200)Note. A. Normal control group; B. Model control group; C. Dexamethasone group;D. Sodium houttuyfonate group.Fig.1 Pathological changes of lung tissue in the rats (×200)

1.2.2 观察标本以及采集

所有动物于造模后第29天，用20%乌拉坦5.0 mL/kg腹腔麻醉。肺样本：剖去肺部周围组织，取右肺上叶，生理盐水冲洗后，放在4%甲醛溶液中保存；取右肺下叶置于液氮罐中作肺组织PI3K、AKT1、mTOR mRNA表达检测。

1.2.3 实时荧光定量PCR法检测肺组织PI3K、AKT1、mTOR mRNA表达

按美国Invitrogen公司Trizol试剂提取总RNA后，逆转录合成cDNA。12 μL反应体系中，10 mmol/L dNTP 1 μL，随机引物1 μL，标本RNA 2 g，混匀后于65℃ 5 min，快速插入冰水中，离心，冰上加入：5× buffer 4 μL, DTT(100 mmol/L)2 μL, RNAsin(40 U/μL)1 μL, M-MLVRT反转录酶(200 U/μL)1 μL，37℃ 50 min，70℃ 15 min，-20℃保存。PCR扩增：SYBR green 10 μL，上游引物(5 mol/L)2 μL，下游引物(5 mol/L)2 mμL，反转录产物2 μL，扩增条件① 95℃ 10 s；②95℃ 5 s，60℃ 20 s，40 Cycles。数据采用仪器自带软件ABIPrism 7300 SDS Software 分析。PI3K、AKT1、mTOR表达水平以它们与actin的相对表达量来计算。

1.2.4 病理观察

右上肺组织常规4%甲醛固定，取材进行脱水和浸蜡后用石蜡包埋，用切片机切取一片，漂片，常规HE和胶原染色，光镜下观察肺组织病理形态学的变化。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织病理形态学观察

光镜观察：正常组肺泡结构清晰,胶原染色未见明显纤维组织增生；模型组局部肺实变，肺泡腔内大量中性粒细胞浸润，胶原染色显示肺间质纤维组织大量增生；地塞米松组和鱼腥草素钠组肺间质极少量炎症细胞浸润，胶原染色显示肺间质少量纤维组织增生。(见图1)

2.2 鱼腥草素纳对大鼠肺组织PI3K、AKT1和mTOR基因表达的影响

与正常组比较，模型组肺组织中PI3K和AKT1基因表达明显升高(P<0.05，P<0.01)、mTOR基因表达明显降低(P<0.01)；与模型组比较，鱼腥草素纳组和地塞米松组肺组织PI3K和AKT1基因表达明显降低(P<0.05，P<0.01)、mTOR基因表达明显升高(P<0.01)；与地塞米松组比较，鱼腥草素纳组肺组织mTOR基因表达明显升高(P<0.05)。(见表1)

表1 各组大鼠肺组织PI3K、AKT1和mTOR基因表达的比较Tab.1 Expression of PI3K and AKT and mTOR genes in the lung tissues of rats in each group(±s, n=6)

注：与正常组比较，△△P<0.01，△P<0.05；与模型组比较，▲▲P<0.01，▲P<0.05；与地塞米松组比较，##P<0.01，#P<0.05。

Note. Compared with the normal group,△△P<0.01，△P<0.05.Compared with the model group，▲▲P<0.01，▲P<0.05.Compared with the dexamethasone group，##P<0.01，#P<0.05.

3 讨论

PI3K/AKT/mTOR是细胞内的经典信号通路，参与细胞炎症、细胞凋亡和自噬等环节，在COPD发展和转归中有重要作用。研究表明，胰岛素通过激活PI3K/AKT通路，抑制TLR3(Toll-like receptor 3, TLR3)诱导的人支气管上皮细胞凋亡，减轻COPD炎症损伤，提示PI3K/AKT信号通路可抗细胞凋亡而减轻COPD气道炎症[7]。香烟烟雾提取物通过诱导PI3K/AKT磷酸化增加，促进人气道上皮细胞间质转化，导致COPD患者小气道纤维化[8]。而抑制PI3K/AKT则减少香烟烟雾诱导的上皮细胞间质转化，减轻COPD肺部纤维化[9]。

PI3K是细胞质中能催化磷脂酰肌醇D3位磷酸化的一种脂类激酶。I型PI3K由调节亚基P85和催化亚基P110组成。AKT是进化上高度保守的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，约由480个氨基酸残基组成，是PI3K下游的关键蛋白[10]。mTOR属于磷脂肌醇3-激酶(PIKK)相关激酶家族，是一种存在于胞质中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。 mTOR主要通过响应外界环境中能量、营养和生长因子等刺激，参与调控细胞生长、增殖和存活等病理生理过程，包括：炎症过程和细胞自噬的调控。在体内，可与机体其他蛋白形成不同复合物mTORC1和mTORC2,各自发挥不同的功能[11]。生长因子等刺激细胞后，激活PI3K 后使3,4-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)转化为3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，募集AKT和PDK1丝氨酸/苏氨酸激酶，活化AKT并激活mTOR,诱导P70S6K磷酸化S6核糖体，导致内皮细胞分化和细胞增殖，促进上皮细胞间质转化[12]。

研究表明,鱼腥草蒸馏提取物通过抑制TGF-β1/Smad2/3 信号通路，从而修复模型大鼠的肺纤维化[13]。 鱼腥草素钠剂量依赖性地降低阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)诱导的膜性肾小球肾炎BALB/c 小鼠NF-κB和MCP-1 的水平，其抗炎作用可能与抑制NF-κB诱导的细胞因子通路有关[14]。

本实验研究结果表明,与正常组比较，模型组局部肺实变，肺泡腔内大量中性粒细胞浸润，胶原染色显示肺间质纤维组织大量增生，表明COPD模型复制成功。且模型组肺组织PI3K、AKT1基因表达升高，mTOR基因表达降低，表明COPD发病机制与PI3K、AKT1基因表达升高及mTOR基因表达降低有关。与模型组比较, 鱼腥草素钠组肺组织病理改变减轻，且鱼腥草素钠组肺组织PI3K和AKT1基因表达降低、mTOR基因表达升高。表明鱼腥草素钠能够减轻慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺组织损伤，其机制可能与其能够下调PI3K、AKT1 mRNA基因表达、上调mTOR基因表达有关。

References)

[1] 范春红, 李时悦．IL-32、INF-γ、IL-1β与慢性阻塞性肺疾病的研究[J].中国医药导报, 2011, 8(3): 17-19.

Fan CH，Li SY.Study on IL-32, INF-γ, IL-1β and chronic obstructive pulmonary disease[J].Chin Med Herald, 2011, 8(3): 17-19.

[2] Jiang H, Abel PW,Toews ML,et al. Phosphoinositide 3-kinase gamma regulates airway smooth muscle contraction by modulating calcium oscillations [J]．J Pharmacol Exp Ther, 2010, 334(3): 703-709．

[3] 闫玲玲, 张海英,杨爱东,等. 加味小青龙汤对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺组织TLR4、MyD88和SOCS1mRNA表达的影响 [J]．时珍国医国药, 2015, 26(8): 1879-1881.

Yan LL, Zhang HY,Yang AD,et al.Effects of additional Xiao Qing Long Decoction on lung expression of TLR4 and MyD88 and SOCS1mRNA in rats with chronic obstructive pulmonary disease [J].Lishizhen Med Mater Med Res,2015, 26(8): 1879-1881.

[4] 张海英, 闫玲玲, 杨爱东, 等. 加味小青龙汤对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织核转录因子-κB、锌指蛋白A20表达的影响 [J]. 中国中医基础医学杂志, 2015, 20(2): 149-152.

Zhang HY,Yan LL,Yang AD,et al.Effects of additional Xiao Qing Long Decoction on lung expression of NF-kBp65 and A20 protein and its mRNA in rats with chronic obstructive pulmonary disease [J].Chin J Basic Med Tradit Chin Med,2015, 20(2): 149-152.

[5] 李红梅, 崔德健, 佟欣, 等. 熏香烟加气管注内毒素和单纯熏香烟建立大鼠COPD模型 [J]. 中国病理生理杂志, 2002, 18(7): 808-812.

Li HM,Cui DJ,Tong X,et al.Establishment of chronic obstructive pulmonary disease rat models by passive cigarette smoking and intratracheal instillation of lipopolysaccharide [J]. Chin J Pathophysiol,2002, 18(7): 808-812.

[6] 陈奇．中药药理研究方法学 [M]. 北京：人民卫生出版社,1996: 1103.

Cheng Q.Research methods in pharmacology of Chinese matera medica[M].Beijing：People’s Medical Publishing House,1996: 1103.

[7] Numata T, Araya J, Fujii S, et al. Insulin-dependent phosphatidylinositol 3-kinase/Akt and ERK signaling pathways inhibit TLR3-mediated human bronchial epithelial cell apoptosis [J]. J Immunol, 2011, 187(1): 510-519.

[8] Shen HJ, Sun YH, Zhang SJ, et al. Cigarette smoke-induced alveolar epithelial-mesenchymal transition is mediated by Rac1 activation [J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1840(6): 1838-1849.

[9] Wang Q, Wang Y, Zhang Y, et al. The role of uPAR in epithelial-mesenchymal transition in small airway epithelium of patients with chronic obstructives pulmonary disease [J]. Respir Res, 2013, 14: 67.

[10] Coffer PJ, Jin J, Woodgett JR. Protein kinase B (C-Akt): a multifunctional mediator of phosphatidylinositol 3-kinase activation [J]. Biochem J, 1998, 335(Pt1): 1-13.

[11] 李晓菲, 陶玉芬, 刘建生, 等. LPS/D-gal诱导小鼠急性肝炎模型及mTOR信号的变化 [J]. 中国实验动物学学报, 2015, 23(3): 307-311.

Li XF,Tao YF,Liu JS, et al. A murine model of LPS /D-gal-induced acute hepatitis and alterations in mTOR signaling [J]. Acta Lab Anim Sci Sin, 2015, 23(3): 307-311.

[12] Cui J, Zhang F, Wang Y, et al. Macrophage migration inhibitory factor promotes cardiac stem cell proliferation and endothelial differentiation through the activation of the PI3K/Akt/mTOR and AMPK pathways [J]. Int J Mol Med, 2016, 37(5): 1299-1309.

[13] Du SH, Li H, Cui YH, et al. Houttuynia cordata inhibits lipopolysaccharide-induced rapid pulmonary fibrosis by up-regulating IFN-γ and inhibiting the TGF-β1/Smad pathway [J]. Int Immunopharmacol, 2012, 13(3): 331-340.

[14] Pan P, Wang YJ, Han L, et al. Effects of sodium houttuyfonate on expression of NF-kB and MCP-1 in membranous glomerulonephritis [J]. J Ethnopharmacol, 2010, 131: 203-209.