抑制外周神经元PAR2-PKA/PKCε通路对痛转化模型大鼠痛阈的影响

房军帆，王思思，孙海榉，邵晓梅，梁宜，方剑乔，杜俊英*

(1. 浙江中医药大学第三临床医学院，杭州 310005； 2. 浙江中医药大学，杭州 310053)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

慢性疼痛是长期以来困扰医学界的主要难题之一。导致该问题的主要原因之一，是慢性痛的产生机制至今尚不明确。部分疼痛研究者提出，慢性痛、急性痛和持续性疼痛三者可能具有完全不一样的机制[1-3]。但是现有的大量疼痛动物模型，或为持续性疼痛动物模型，或急/慢性疼痛同时存在，难以精确确定慢性痛产生或转化的时间点，限制了慢性疼痛产生机制的深入研究[4-5]。

动物敏化诱发(hyperalgesia priming)模型是一种较为特殊的疼痛动物模型[6- 7]。该模型通过两次药物干预制造慢性疼痛动物模型。该模型的特点在于，慢性疼痛的产生被人为控制，从而使慢性疼痛与急性疼痛分离，为研究急性痛如何向慢性转化(痛转化)和慢性痛的产生机制提供了良好的动物模型。

基于该模型，有部分研究指出，外周神经元中蛋白酶激活受体2(proteinase-activated receptors 2，PAR2)通路的活化与痛转化密切相关[8]，其下游物质蛋白激酶Cε(PKCε)和蛋白激酶A(PKA)均部分参与了痛转化的产生[9-10]。其中PKA可能主要参与急性痛阶段，而PKCε可能主要参与慢性痛阶段。本研究拟建立动物敏化诱发模型，探索抑制PAR2活化是否能同时抑制痛转化过程中的急性痛和慢性痛，并为疼痛研究介绍新的动物模型和研究思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄、清洁级雄性健康SD大鼠30只，体重200～220 g，购自上海斯莱克实验动物责任有限公司【SCXK(沪)2013-0016】，由浙江中医药大学实验动物中心饲养【SYXK(浙)2013-184】。饲养期间给予啮齿类动物标准颗粒饲料和饮水，恒温20～24℃，恒湿50%～70%。并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 试剂与仪器

PGE2(Sigma-Aldrich公司，P5640)；FSLLRY-NH2(Tocris公司，245329-02-6)；兔抗大鼠PAR2一抗(Proteintech公司，12160-1-AP)；兔抗大鼠PKCε一抗(Proteintech公司，20877-1-AP)；兔抗大鼠PKA一抗(Santa Cruz公司，sc-365615)；兔抗大鼠GAPDH一抗(Cell Signaling Technology公司，3683)；生物素标记山羊抗兔二抗(Abcam公司，ab6721)；PVDF膜(Milipore公司，IPVH00010)；其余试剂均为市售分析纯级。

Von-Fery丝套装(美国Stoelting公司)；多功能全波长酶标仪(美国Molecular Devices公司)；垂直电泳槽、快速半干转印仪器(美国Bio-Red公司)；Image4000凝胶成像系统(美国GE公司)。

1.3 分组及处理

采用随机数字法将实验大鼠随机分为空白组(control组)、假诱发组(sham model组)、诱发组(model组)、抑制剂1组(iPAR2-1组)和抑制剂2组(iPAR2-2组)，每组6只。

诱发组、抑制剂1组、抑制剂2组大鼠于左侧后足足底皮下注射1%角叉菜胶0.1 mL，7 d后于相同足足背注射100 ng /25 μL PGE2[11]。

假诱发组大鼠于左侧后足足底皮下注射生理盐水0.1 mL，7 d后与相同足足背注射100 ng /25 μL PGE2。空白组大鼠于左侧后足足底皮下注射生理盐水0.1 mL，7 d后与相同组足背注射生理盐水25 μL。抑制剂1组大鼠在PGE2注射前5 min，于造模足足背注射PAR2抑制剂FSLLRY-NH2 10 μg/25 μL。抑制剂2组大鼠在PGE2注射后5 min，于造模足足背注射PAR2抑制剂FSLLRY-NH2 10 μg/25 μL。

1.4 痛阈观察

采用Von Frey进行痛阈测量[12]。选取0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 g和26.0 g总计9种强度的Von Frey丝。将大鼠置于不锈钢丝网上的有机玻璃罩内。待大鼠安静后，从4.0 g强度Von Frey丝开始测量。将Von Frey丝对准大鼠左后足足底(劈开足垫)，缓慢上抬Von Frey丝，至丝弯曲成S形，连续刺激8 s。如大鼠产生逃避则记录为X，并降低Von Frey丝强度继续测量。如大鼠未产生逃避则记录为O，并提升Von Frey丝强度继续测量。连续进行6次测量，每次测量最小间隔2 min，获得一组XO组合序列。按如下公式进行痛阈计算：MWT(g)=(10[Xf + κδ])/10 000。Xf代表最后一次测量的Von Fery丝强度，κ值由“X”、“O”组合序列查表后获得，δ约等于0.231(各强度Von Frey丝力度取对数后差值的平均值)。如最后计算结果超过Von Frey丝所含强度(>26.0 g或<0.4 g)，则取26.0 g或0.4 g作为最后结果。行为学测量时间固定在9:00-16:00，环境温度：(23±2)℃。

1.5 免疫印迹检测大鼠L4-L6背根神经节(DRG)PAR2、PKA和PKCε的表达

注射角叉菜胶(生理盐水)后7 d 24 h，完成痛阈测量后，腹腔麻醉大鼠。经升主动脉灌注预冷0.9% NaCl溶液。快速取出左侧L4-L6背根神经节，置于-80℃待用。DRG放入RIPA裂解液中超声粉碎，离心取上清液，BCA蛋白定量。取20 μg蛋白上样，5% SDS- PAGE电泳后转印至PVDF膜，10%脱脂奶粉封闭，分别用兔抗大鼠的PAR2、PKA、PKCε和小鼠抗大鼠GAPDH抗体孵育，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗或山羊抗小鼠二抗孵育，ECL试剂盒显色后拍照，计算条带的平均光密度值，GAPDH为内部对照。

1.6 统计学分析

所有数据均以均数±标准误表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。均以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 痛觉敏化诱发大鼠PWTs改变

角叉菜胶注射后5 h，model组大鼠PWTs明显减低，低于同期control组(P<0.01)，该效应一直持续到角叉菜胶注射后3 d(P<0.01)。至注射后6 d，角叉菜胶的致痛效应彻底消退，与同期control组差异无显著性(P>0.05)。注射生理盐水无致痛效应，sham model组在注射后6 d内，大鼠PWTs与control组比差异无显著性(P>0.05)。注射后7 d，给予model组和sham model组大鼠PGE2足背注射处理。

给予PGE2后0.5 h，model组和sham model组大鼠PWTs均快速下降，明显低于同期control组(P<0.01)。至PGE2注射后24 h，model组大鼠PWTs一直维持在低水平，显著低于同期control组(P<0.01)。而sham model组大鼠PWTs快速恢复正常，在PGE2注射后4 h即与control组大鼠处于同一水平，差异无显著性(P>0.05)。以上结果提示，先后给予角叉菜胶和PGE2能诱导大鼠产生痛觉敏化 (图1)。

注:与同期空白组比较：**P<0.01；与同期假诱发组比较：△△P<0.01。图1 大鼠机械痛阈改变Note. **P<0.01，versus the control group.△△P<0.01，versus the sham model group.Fig.1 Changes of paw withdrawal thresholds in the rats

2.2 痛觉敏化诱发大鼠DRG中PAR2，PKA，PKCε表达改变

PGE2注射后24 h，model大鼠左侧L4-6DRG中PAR2和PKCε表达均显著增高(图2 A，C)，明显多于同期control组大鼠(P<0.01)。而sham model组大鼠PAR2和PKCε表达均无明显改变(图2 A，C)，与control组相比差异无显著性(P>0.05)。PGE2注射后24 h，三组大鼠左侧L4-6DRG中PKA表达处于同一水平(图2B)，三组间比较差异无显著性(P>0.05)。以上提示，DRG中PAR2和PKCε表达增多可能与大鼠痛觉敏化发生相关。

注: A.大鼠腰段DRG神经元PAR2蛋白表达统计图和western blot代表图；B.大鼠腰段DRG神经元PKA蛋白表达统计和western blot代表图；C.大鼠腰段DRG神经元PKCε蛋白表达统计和western blot代表图；空白组比较：**P<0.01；与假模型组比较：△△P<0.01。图2 大鼠腰段DRG神经元PAR2、PKA和PKCε蛋白表达Note. A. The expression levels of PAR2 in the rat lumbar DRG neurons and a representive image of western blot. B. The expression levels of PKA in the rat lumbar DRG neurons and a representive image of western blot. C.The expression levels of PKCε in the rat lumbar DRG neurons and the representive image of western blot. **P<0.01，versus the control group；△△P<0.01，versus the sham model group.Fig.2 Expression levels of PAR2, PKA and PKCε in the rat lumbar DRG neurons

2.3 不同时间点注射PAR2抑制剂对大鼠PWTs的影响

不论是在PGE2注射前给予PAR2抑制剂(图3 A)，还是在PGE2注射后给予PAR2抑制剂(图3B)，均未能干预PGE2注射后4 h内，大鼠PWTs的降低。给予PGE2后4 h，即角叉菜胶/生理盐水注射后7 d 4 h，iPAR2-1和iPAR2-2组大鼠PTWs与sham model组相比差异无显著性(P>0.05)。但是，在PGE2注射后24 h，给予PAR2抑制剂的大鼠，其PWTs均出现了明显的回升，iPAR2-1和iPAR2-2组大鼠PTWs显著高于同期sham model组(P<0.01)。其中，在PGE2注射前给予PAR2抑制剂，大鼠PWTs能完全恢复至正常水平，与同期sham model组相比差异无显著性(P>0.05)(图3 A)。而在PGE2注射后给予PAR2抑制剂，仅能部分恢复7 d 24 h大鼠PWTs，仍低于同期sham model组(P<0.01)(图3B)。

注: A.PGE2注射前给予PAR2抑制剂对大鼠机械痛阈的影响；B. PGE2注射后给予PAR2抑制剂对大鼠机械痛阈的影响PGE2注射前给予PAR2抑制剂对大鼠机械痛阈的影响；与同期假诱发组比较：△△P<0.01；与同期诱发组相比：## P<0.01。图3 PAR2抑制剂对大鼠机械痛阈改变的影响Note.A. Effect of PAR2 inhibitor on the paw withdrawal thresholds in the rats when it was administerted before PGE2 injection. B. Effect of PAR2 inhibitor on the paw withdrawal thresholds in the rats when it was administerted after PGE2 injection. △△P<0.01，versus the sham model group；## P<0.01，versus the model group.Fig.3 Effect of PAR2 inhibitor on the changes of paw withdrawal thresholds in the rats

2.4 不同时间点注射PAR2抑制剂对DRG中PKCε和PKA表达的影响

给予PAR2抑制剂，无论是在PGE2注射前还是PGE2注射后，均能明显抑制大鼠L4-6DRG中PKCε的高表达(图4C，D)，PGE2注射后24 h，iPAR2-1和iPAR2-2组大鼠腰段DRG中PKCε表达显著低于同期model组大鼠(P<0.05)，与同期sham model组相比差异无显著性(P>0.05)。但是，给予PAR2并未对PKA表达产生任何作用(图4 A，B)，iPAR2-1组和iPAR2-2组大鼠腰段PKA表达与model组相比差异无显著性(P>0.05)。

注: A.PGE2注射前给予iPAR2对大鼠腰段DRG神经元PKA蛋白表达的影响；B.PGE2注射后给予iPAR2对大鼠腰段DRG神经元PKA蛋白表达的影响；C.PGE2注射前给予iPAR2对大鼠腰段DRG神经元PKCε蛋白表达的影响；D.PGE2注射后给予iPAR2对大鼠腰段DRG神经元PKCε蛋白表达的影响；与同期假模型组相比：△△P<0.01；与同期模型组相比：#P<0.05。图4 大鼠腰段DRG神经元PKA和PKCε蛋白表达Note.A. The effect of iPAR2 on the expression levels of PKA in lumbar DRG neurons of the rats when it was given before PGE2 injection. B. The effect of iPAR2 on the expression levels of PKA in lumbar DRG neurons of the rats when it was given after PGE2 injection. C. The effect of iPAR2 on the expression levels of PKCε in lumbar DRG neurons of the rats when it was given before PGE2 injection. D. The effect of iPAR2 on the expression levels of PKCε in lumbar DRG neurons of the rats when it was given after PGE2 injection.△△P<0.01，versus the sham model group；# P<0.05，versus the model group.Fig.4 Expression levels of PKA and PKCε in lumbar DRG neurons of the rats

3 讨论

慢性疼痛的治疗一直是医学界的难题。受限于动物模型，疼痛研究者一直难以将慢性疼痛与持续性疼痛进行分离。比如，经典的慢性炎性痛动物模型，弗氏完全佐剂诱导大鼠足趾局部炎性疼痛。在该模型中，大鼠足趾局部炎症能持续存在14 d以上，导致急性痛(炎症自身诱导)和慢性痛(炎症导致神经可塑性改变产生)相互混杂。又比如传统的神经病理性痛动物模型，人为造成的神经损伤会持续存在，导致神经损伤疼痛(急性痛)和神经可塑性改变疼痛(慢性痛)混杂。这些急/慢性疼痛的混杂，必然导致机制的混杂。如不论在神经病理性疼痛还是炎性疼痛中，外周神经元PKA和PKCε的高表达，均被认为是维持慢性疼痛存在的重要机制[13-14]。但基于痛觉敏化诱发模型的研究发现，慢性疼痛的机制并不一定如此。

痛觉敏化诱发模型的引入，为研究者分别研究急性痛、慢性痛和痛转化提供了可能。该模型的最大特点在于通过2次注射，精确的控制慢性疼痛的产生。炎症刺激后，足底注射前列腺素2(PGE2)诱发的疼痛时间被显著延长，被认为是痛觉过敏的产生。如文中图1所示，正常情况下，PGE2仅能诱导不足4 h的急性疼痛。但当大鼠的神经元发生可塑性改变后，PGE2能诱导出超过24 h的疼痛。这种疼痛没有明确的诱因(如炎症或神经损伤)，能持续存在超过14 d，被认为是相对纯净的慢性疼痛[11]。该模型的另一特点为，在诱发慢性痛前，大鼠的痛阈处于正常状态。即大鼠处于一种外在无明显疼痛表现，而神经元可能已存有某些改变的状态下[15]。为研究者进一步探索慢性痛发病的病理基础提供了可能。

目前，通过对该模型的研究已有部分不同于过往认识的结果。研究者发现，PKA和PKCε在疼痛中扮演的角色并不一样[16]。在疼痛由急性痛向慢性痛转化的过程中，外周神经元中PKA的高表达参与了急性期疼痛，即PGE2刺激导致的疼痛。而PKCε则参与了慢性痛的产生，即痛觉敏化。进一步使用两者的特异性证明，抑制外周PKA表达能有效防止PGE2诱导的急性疼痛(<4 h)，但不能缓解慢性疼痛。抑制外周PKCε表达能有效缓解慢性疼痛的产生(>24 h)，但对于急性疼痛无效。与前人研究一致，本研究中我们观察到造模后24 h，敏化外周神经元中PKCε的高表达，但PKA的表达没有明确改变。以上结果提示，敏化诱发模型复制成功。

PAR2是PKA和PKCε共同的上游物质之一，抑制PAR2能抑制PKA和PKCε的活化[17]。过往的研究表明，PAR2-PKA和PAR2-PKCε通路均参与了疼痛的产生和维持[18-19]。因此，注射PAR2可能能同时改善PGE2诱发的急性痛和慢性痛。本研究中，我们在PGE2注射前后分别进行注射PAR2的特异性抑制剂FSLLRY-NH2，并观察其对敏化诱发大鼠痛阈的影响。PGE2注射前给予FSLLRY-NH2其目的在于同时抑制PKA和PKCε的高表达，而PGE2注射后给予FSLLRY-NH2其目的在于抑制PKCε的高表达，而不影响PKA。结果证明，不论在PGE2注射前还是注射后给予PAR2抑制剂，均能显著改善由PGE2诱发的慢性疼痛，并明显抑制PKCε在外周神经元中的表达。但两种注射方案，均未能改善PGE2诱导的急性疼痛，也未能改变造模后24 h敏化大鼠外周神经元PKA的表达。

综上所述，痛觉敏化诱发模型是一种适用于研究慢性痛的产生的疼痛动物模型。外周神经元PAR2-PKCε通路活化介导了急性痛向慢性痛的转化。但是，介导急性期疼痛的PKA可能并非通过PAR2活化。

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