复方贞术调脂胶囊调控MEKK2-Wnt偶联拮抗β-catenin泛素化改善大鼠糖皮质激素骨质疏松症

洪郭驹，陈鹏，韩晓蕊，何伟，孙平

(1. 广州中医药大学岭南医学中心国家重点学科中医骨伤科学实验室，广州 510405； 2. 广州中医药大学第一附属医院关节骨科，广州 510405； 3. 西澳大利亚大学生物医学科学院，珀斯 6009； 4. 广州市第一人民医院放射科，广州 510006； 5. 广东药科大学第一附属医院骨内科，广州 510000)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid-induced osteoporosis, GIOP)是由于长期使用糖皮质激素(GC)所导致的骨代谢紊乱，主要表现为血清游离脂肪酸含量增高、骨量减少、骨微结构破坏、骨脆性增加和易于骨折[1-2]。而GC作为最具有治疗效力的抗炎和免疫抑制药物广泛应用于炎症性和自身免疫性疾病等多种疾患的治疗中，临床应用的人群规模也在逐渐扩大[3-4]。长期接受GC(>6个月)治疗的慢性疾病人群，最终有30%～50%发展为骨质疏松症[5-6]。GC介导β-catenin泛素化经证实与促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶2(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 2, MEKK2)和Wnt信号传递与偶联密切相关，而有效药物对偶联的促成骨分化作用，将有助于在防治GIOP治疗思路中寻求新突破。

以“补肾祛湿”法为代表的中医方剂对防治GIOP有着良好的应用前景，并在中国积极而广泛的运用于临床，可针对性地解决GIOP中由于长期大量的GC导致的“肾虚脾虚”体内环境，增强人体机能，进而降低血脂含量，提高和补充骨质。“补肾祛湿法”经验方复方贞术调脂胶囊(FTZ)在对抗骨丢失方面有较大的潜力和效力[7-9]。鉴于此，本文建立GIOP大鼠模型，采用micro-CT、qRT-PCR和Western blot等检验等方法，观察FTZ对GIOP骨微结构影响以及调控MEKK2-Wnt偶联拮抗β-catenin泛素化防治GIOP作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

Wistar大鼠48只，SPF级，雄性，体重230～250 g，由广东省医学实验动物中心提供【SCXK(粤)2014-0035】。广州中医药大学动物实验中心【SYXK(粤)2013-0001】标准饲养，标准鼠粮适应性饲养(含钙1.19%、磷0.85%、1045IU维生素D)，室温(23±2)℃，自由饮水，光照和黑夜时间间隔12 h，定期消毒及通风，各组大鼠均单笼培养。实验在广州中医药大学动物实验中心及广州中医药大学岭南医学中心国家重点学科中医骨伤科学实验室完成。

1.1.2 试剂与仪器

注射用甲泼尼龙琥珀酸钠(辉瑞公司，美国)；Lipopolysaccharide(Sigma公司，美国)；Protease Inhibitor Cocktail Set III(Calbiochem公司，美国)；一抗Wnt3a鼠抗、β-catenin兔抗(Sigma公司，美国)；MEKK2兔抗(Abcam公司，美国)；GAPDH(CST公司，美国)；HRP山羊抗小鼠IgG二抗、HRP山羊抗兔IgG二抗、碱性磷酸酶检测试剂盒、DEPC处理水(上海碧云天生物技术有限公司，中国)；茜素红染色检测试剂盒(广州赛业生物科技有限公司，中国)；PCR试剂盒(Roche公司，美国)；PCR引物(生工生物工程(上海)有限公司，中国)；TP1020自动脱水机(Leica Biosystems公司，美国)、Autos全自动染色机(Leica公司，德国)；BX53显微镜(Olympus公司，日本)；micro-CT100柜式锥形束微型CT(Scanco公司，瑞士)；Image-pro plus软件(Media Cybernetics公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组

Wistar大鼠48只，随机分为4组：正常对照组、甲强龙组(MPS，模型组)：参照Hulley的方法，皮下注射甲强龙(methylprednisolone, MPS)5 mg/(kg·d)，每周5次、甲强龙组(Met)+皮下注射生理盐水(空白对照组)、甲强龙组(MPS)+FTZ灌胃(实验组)。各组适应性喂养7 d后进入实验期12周。

1.2.2 GIOP造模与干预方法

GIOP造模方法如下，腹部肌肉注射MPS 5 mg/(kg·d)，隔间24 h连续注射6次。注射MPS期间，每天每只大鼠相应腹部处注射青霉素10万单位，连续6次，预防感染。腹部注射FTZ 按照人的临床等量剂量换算。正常组注射与FTZ等体积生理盐水。

1.2.3 Micro-CT检测

(1)扫描参数：由Scanco公司提供μCT100柜式锥形束微型CT。X线5 μm焦点直径，30-90 kVp/20-50 keV(160 μA)；探测器为3072×400；分辨率：1.25 μm, 4 μm；图像矩阵：512×512至8192×8192。扫描尺寸为100 mm×140 mm(φXl)。

(2)扫描方法：将纳入研究的GIOP大鼠及对照组通过尾静脉空气注射处死，延双侧臀肌外侧切开，暴露双侧股骨头，用咬骨嵌取下左侧股骨头及转子部(不破坏及挤压股骨头部骨小梁)。给予4%多聚甲醛固定2周。将股骨纵轴与显微CT 检查床滑轨的移动轴平行近端进行micro-CT 扫描。对micro-CT扫描图像经校准后手动选取股骨头区域建立三维兴趣区(region of interest，ROI)，兴趣区为完整股骨头区域。

(3)检测指标：组织体积(TV，tissue volume)、骨体积(BV，bone volume)；在直接测量和三角测量法(triangulation，TRI)模式下，对骨小梁数量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分离度(trabecular separation/spacing，Tb.Sp)；并进行三维重建。

1.2.4 苏木精-伊红(HE)染色

截取股骨全长并剔除周围肌肉，沿正中冠状面剖开，用4%甲醛溶液(pH 7.4)固定48 h，再置于10% EDTA-Tris缓冲液中脱钙，隔天更换脱钙液，直至完全脱钙以后，流水冲洗，逐级乙醇脱水，二甲苯透明处理2 h，石蜡包埋、切片，切片厚度为4 μm，常规HE染色。光镜下观察骨髓腔内骨髓细胞、骨小梁及骨细胞形态等。

1.2.5 GIOP大鼠来源BMSCs与FTZ干预

(1)细胞培养：DMEM培养基内含100 IU青霉素、100 μg/mL链霉素，三维支架经PBS缓冲液冲洗后置于DMEM培养基中。选取3.5月龄SPF级雄性大鼠20只建立GIOP模型后(方法同上述动物实验)，分离模型大鼠骨髓间充质干细胞 (bone mesenchymal stem cells, BMSCs) 细胞，先在DMEM培养基中培养至细胞密度2×106个/40 μL，分别行成骨诱导分化。

(2)FTZ含药血清制备：SPF级雄性大鼠10只，参照《药理实验方法学》中人鼠用药量及体表面积计算得出Wistar大鼠的等效剂量，以5倍等效剂量对FTZ含药血清组大鼠进行灌胃，2次/日，连续给药7 d，第8天清晨一次灌服全天剂量，1 h后用体积分数10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采集血液后在3 000 r/min离心15 min后分别获得FTZ含药血清及正常大鼠血清，相同组别大鼠血清合并，经56℃恒温水浴灭火30 min，-20℃冰箱保存备用。

1.2.6 染色法检测成骨分化能力

将模型组大鼠腹部解剖，收集腹主动脉血液，并进行分离提取BMSCs。将BMSCs分为四组，包括空白对照组、50 ng/mL BMP2(对照组)、20 ng/mL FTZ(实验组)。50 ng/mL BMP2和20 ng/mL FTZ进行成骨诱导液诱导BMSCs。

(1)碱性磷酸酶(ALP)法检测细胞分化：BMSCs使用胰酶进行消化，以1×104mL-1孔密度接种于96孔板(设6个复孔)，培养24 h，吸去培养基，加入相应的处理培养基，培养48 h后，根据ALP 试剂盒说明书进行检测。

(2)钙化结节染色：将BMSCs以1×104mL-1孔密度接种于6孔培养板上，培养24 h，根据分组加入相应的含药培养基(每孔2 mL)，每种浓度设2个复孔，每72 h液一次，连续培养21 d，经茜素红染色后，显微镜观察钙化结节形成过程。

1.2.7 qRT-PCR

(1)cDNA 的合成：按下列组份配置 RT 反应液(在冰上进行)：反应液轻柔混合后进行反转录反应，条件如下：37℃ 15 min、85℃ 5 sec、4℃。合成试剂：1×PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time), 2 μL；RNase Free dH2O, 10 μL。

(2)荧光定PCR分析：PCR验证成骨细胞标志物ALP、Runx2、OCN表达；通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/进入Genbank数据库，查找相应的基因序列，根据基因 mRNA 的序列，利用 Primer3Plus 软件进行引物设计，利用Oligo7软件对引物结构进行分析，利用网站进行引物的特异性分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)。设置NTC 对照以验证实验材料有无污染、NRT 对照以明确有无基因组污染。以β照以明确有无为内参，每个样品3复孔，按下列组份配置 PCR反应液(在冰上进行)：1×SYBR Premix Ex Taq II (Tli RnaseH Plus) (2×), 12.5 μL；0.4 mmol/L×PCR Forward Primer (10 μL), 1 μL；0.4 mmol/L×PCR Reverse Primer (10 μL), 1 μL；DNA模版 (<100 ng)，2 μL；dH2O (灭菌蒸馏水) (8.5 μL)。

(3)采用两步法PCR 扩增标准程序：Step1：95℃ 30 s；Step2：PCR 反应；GOTO：39(40Cycles)；95℃ 5 s；60℃ 30 s；Step3：Melt Curve。根据扩增效率选择ΔΔ据扩法或Pfaffl法统计各组各感兴趣基因相对表达量的差异，并将RT-qPCR 的结果与RNA-seq定量分析的结果进行Pearson 相关分析。

1.2.8 Western blot检测

样品制备：对于骨组织，用液氮预冷，从液氮中取出德股骨头称重后放入研磨钵中，研磨至粉末状，按50 mg骨组织/200 μL RIPA裂解液制备样品。BMSCs用裂解液裂解细胞，刮净培养板，SDS-PAGE：分别制备10%分离胶、5%浓缩胶，待凝胶聚合后，注入电泳缓冲液。样品裂解液与上样缓冲液按5∶1充分混匀，置沸水浴中加热5 min，冷却后用微量移液器吸取样品与预染蛋白marker点样并电泳。转膜缓冲液中制作滤纸、凝胶、PVDF膜 “三明治”，350 mA转膜3 h。取出 PVDF膜置于盛有5%脱脂奶粉的封闭液的平皿中，置于摇床上室温封闭1 h。倾倒封闭液，加入一抗(Wnt3a、MEKK2、p-MEKK2/3、β-catenin按1∶1000稀释，GAPDH按1∶2000稀释)，摇床上室温振荡孵育2～4 h，孵育过夜。回收一抗，用TBST洗涤3～5次，每次10 min。加入相应二抗(1∶1000)。TBST洗涤3次，每次5 min，TBS洗涤1次，1 min。将发光显色试剂盒中的显色剂A和B等体积混合后，加在PVDF膜上充分接触反应2 min后，将PVDF膜移至另一保鲜袋中，放入凝胶成像系统中进行成像分析。先曝光约3～5 min，根据信号的强弱适当调整曝光时间，分析结果，使用image-pro plus软件进行半定量分析。

1.2.9 Luciferase报告实验

以TOPFlash为报告质粒，FOPFlash为阴性对照。用lipofectamine 3000转染。转染质粒前24 h将BMSCs以1×104mL-1孔密度接种至96孔板中，根据操作说明书向每孔中转染TOP-Flash或FOP-Flash和pRL-TK质粒共转染BMSCs。转染24 h后按空白对照组、BMP2、FTZ更换诱导液，继续培养48 h，随后裂解细胞。采用双荧光素酶报告系统在多功能微孔板分析仪上测定光值，读取荧光值和吸光值，二者的比值即为该质粒转染细胞所得的荧光素酶的相对活性。以对照组均值为100%计, 其他处理组与对照组的比值为相对β-catenin/TCF/LEF转录活性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。计量资料结果以均数±标准差表示，采用组间两独立样本t检验及方差分析(one-way ANOVA) 进行统计分析，P<0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 GIOP造模过程事件分析

Wistar大鼠48只。36只用于建立GIOP模型，其有2只在注射MPS后24 h死亡，34只存活，存活率为95%，补足后。甲强龙组(模型组)、甲强龙+生理盐水灌胃组(阴性对照组)、甲强龙+FTZ灌胃(实验组)在除甲强龙干预前共有36只出现骨质疏松征象，骨质疏松发生率为90%(9/10)。

2.2 GIOP模型造模与干预评价

Wistar大鼠用于建立GIOP模型：模型组：骨小梁稀疏变细，出现骨髓细胞碎片，细胞数目及网状结构较正常稀疏。正常组：骨小梁完整，骨小梁中的骨细胞清晰可见。可见成骨活动较为活跃，骨小梁形态较好；D为阳性对照组。各组骨小梁与组织体积比比较，实验组与模型组之间差异有显著性(P<0.05)。(见图1)

注：A.正常对照组(a)、模型组(b)、实验组(c)、空白对照组(d)；B. 各组BT/TV比值图1 各组大鼠镜下组织病理切片(×100)Note. Fig. 1 A: sham group (a), GIOP group (b), FTZ group (c), blank Group (d). Fig. 1B: Ratio of BT/TV for each group (±s，g), *P<0.05.Fig.1 Histological changes in bone tissues of the rats

2.3 Micro-CT检测GIOP模型骨微结构

Micro-CT检测发现，模型组与正常对照组相比，前者BV/TV、Tb.N、Tb.Th值降低，Tb.Sp值升高(P<0.05)。实验组与模型组相比，前者BV/TV、Tb.N、Tb.Th值升高，Tb.Sp值降低(P<0.05)，差异有显著性(P<0.05)，空白对照组相应指标与模型组差异有显著性(P<0.05)(图2B)。ROI三维重建可见模型组骨小梁紊乱，可见普遍断裂，骨质较少；实验组相对而言骨质改善，骨小梁有局部性修复，说明FTZ增加GIOP大鼠模型的骨小梁修复和促进微观骨性结构改善(图2A)。

2.4 FTZ调控骨组织内Wnt3a、MEKK2、β-catenin蛋白表达

运用Western Blot进行检测MEKK2-Wnt偶联的关键蛋白Wnt3a、MEKK2、β-catenin蛋白表达水平。结果如图3显示，在实验组内，Wnt3a蛋白表达水平较模型组高，MEKK2蛋白表达水平较模型组升高，β-catenin蛋白表达水平较模型组增高，模型组与空白对照组差异无显著性(P>0.05)，提示FTZ调控骨组织内Wnt3a、MEKK2、β-catenin蛋白表达，通过MEKK2-Wnt偶联信号通路从而促进GIOP成骨功能。

2.5 FTZ促进碱性磷酸酶染色和茜素红染色

同等干预条件下，各组BMSCs接受经茜素红染色检测矿化结节，如图4 A、B所示。BMP2和FTZ干预后形成的矿化密度均显著高于对照组，差异有显著性(P<0.05)，FTZ处理组矿化密度较BMP2处理组少，结果提示 FTZ能显著增强BMP2的矿化能力。如图4C、D，与对照组相比，FTZ对正常大鼠BMSCs具有成骨诱导作用，可显著提高细胞ALP活性，差异有显著性(P<0.05)，但较BMP2诱导效能较弱，差异无显著性(P>0.05)。

2.6 FTZ对成骨相关基因的表达作用影响

分组同前，在干预和诱导BMP2和FTZ后，提取细胞总RNA，qRT-PCR检测成骨相关基因ALP、Runx2、OCN的mRNA表达水平，结果如图5 A显示，BMP2与FTZ诱导组的ALP、Runx2、OCN基因表达均比对照组高，差异有显著性(P<0.05)。与ALP活性检测和茜素红染色实验结果相一致。结果表明FTZ对体外诱导BMSCs向成骨细胞分化的相关基因有促进作用。

注：A. 各组Micro-CT三维重建影像；B. 各组BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp等参数比较。正常对照组、模型组、实验组、空白对照组。*P<0.05，**P<0.01。图2 Micro-CT和三维重建Note. A. Three-dimensional micro-CT images of each group (±s, g). B. BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp of the sham group, GIOP group, FTZ group, and blank Group. *P<0.05, **P<0.01.Fig.2 Micro-CT and three-dimensional reconstruction of bones

注：骨组织内Wnt3a(A、D)、MEKK2(B、E)、β-catenin(C、F)蛋白表达图3 FTZ对骨组织内蛋白表达的作用Note. Protein expression of Wnt3a (A, D), MEKK2 (B, E), β-catenin (C, F) in bone tissue (±s，g). Sham group, GIOP group, FTZ group, and blank control group. *P<0.05,**P<0.01.Fig.3 Effect of FTZ on proteins in the bone tissues

注：A～B. 空白对照组、BMP2组、FTZ组的茜素红染色检测及矿化密度比较；C～D. 各组ALP染色检测及ALP密度比较。* P<0. 05，**P<0.01。图4 大鼠骨组织中矿化密度的变化(茜素苏红染色和ALP染色，×200)Note. A-B: blank group, BMP2 group, FTZ group (±s，g), alizarin red staining. C-D: ALP staining and ALP density (±s，g). *P<0.05, **P<0.01.Fig.4 Changes of mineralization density of the rat bone tissues(Alizarin red staining and ALP staning)

2.7 FTZ调控MEKK2、β-catenin蛋白表达

分组同前，对BMSCs进行BMP2和FTZ干预诱导、诱导后行Western Blot检测MEKK2和β-catenin蛋白表达水平，结果如图5B-C显示，BMP2和FTZ干预BMSCs均能明显提高β-catenin的蛋白水平，差异有显著性(P<0.05)。MEKK2与β-catenin 变化规律保持基本一致，经FTZ干预后，BMP2和FTZ组蛋白水平较前逐步上升，差异有显著性(P<0.05)。

2.8 FTZ促进β-catenin/TCF/LEF转录活性

本实验通过检测β-catenin/TCF/LEF转录活性，证实FTZ对Wnt/β-catenin信号通路下游靴基因的激活作用，向BMSCs共转染TOP-Flash质粒和海肾荧光素酶载体pRL-TK进行荧光素酶检测。结果如图所示，与对照组相比， FTZ处理组TOP-Flash报告基因的荧光素酶活性显著增强，FOP-Flash报告基因没有明显变化，在阴性对照组中结果相反。结果说明 FTZ可增强β-catenin/TCF/LEF转录活性，激活Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因的表达，差异有显著性(P<0.05)。

注：A. FTZ对空白对照组、BMP2组、FTZ组成骨相关基因ALP、Runx2、OCN的干预表达作用(从左至右，；B-C. FTZ对BMSCs干预后p-MEKK2/3和β-catenin蛋白表达变化；D. FTZ对β-catenin/TCF/LEF转录活性作用影响，*P<0.05, **P<0.01。图5 FTZ对BMSCs的蛋白、基因表达干预Note. A. Effect of FTZ on osteoblast related genes ALP, Runx2, OCN for blank group, BMP2 group and FTZ group (from left to right, ±s，g). B-C. p-MEKK2/3 and β-catenin proteins in BMSCs in the presence of FTZ (±s，g). D, Effect of FTZ on the transcriptional activity of β-catenin/TCF/LEF. *P<0.05, **P<0.01.Fig.5 Interventional effect of FTZ on the expression of proteins and genes in the BMSCs

3 讨论

GIOP是由于长期使用糖皮质激素(glucocorticoid, GC)所导致的骨代谢紊乱所致，主要表现为血清游离脂肪酸含量增高，骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化降低，骨量减少[1, 2, 10]。作为继发性的骨质疏松症，GIOP是中青年人群发生骨质疏松症和医源性骨质疏松症的重要诱因[10-11]。如何拮抗GC副作用以有效防治GIOP中骨代谢紊乱具有关键性意义。(1)目前认为GC通过经典Wnt/β-catenin通路扰乱骨细胞分化[12]。而另有研究认为，MEKK2经非经典β-catenin通路调控，是抑制脂肪堆积，稳定成骨细胞活性的另一关键环节，与Wnt通路通过偶联机制共同对β-catenin泛素化进行调控[13]。

GC抑制Wnt/β-catenin经典通路，加速β-catenin磷酸化降解，从而激活泛素系统是造成GIOP的重要环节和基础分子机制。MEKK2可有效的维持β-catenin的稳定。研究表明，过表达的MEKK2会导致β-catenin表达呈剂量依赖性的增加，而正是这一种正向调控作用对维持成骨细胞内β-catenin的稳定性至关重要。MEKK2属于MAPK家族中MEKK/SET11亚家族成员。最初MEKK2作为JNK信号途径强有力的激活剂，主要的认识在于激活ERK1/2、ERK5和P38等其他MAPK信号转导途径，进而影响成骨细胞的增殖、分化、凋亡等生理过程[14]。但随后这一价值被进一步研究，而MEKK2作为骨形成调控的重要性也逐步凸现。研究者在敲除了Mekk2-/-狗的颅盖骨培养的成骨细胞中，发现成骨指标COL-Ⅰ、骨涎蛋白(Bsp)、骨钙素(OC)表达显著降低，细胞矿化能力减弱和骨形成率降低。在Mekk2-/-和 Fgf2-/-小鼠的表型中观察到，动物模型骨量的减少和骨量降低一致，表明FGF2/MEKK2作为一个调控共同体有助于维持成人骨量[15]。

MEKK2通过非经典通路来抑制β-catenin泛素化，控制β-catenin的稳定性以维持骨细胞活性。该途径在生物化学和功能上均独立于经典的Wnt介导的β-catenin[13, 16]。具体的信号路径如下：FGF2激活MEKK2，并且在S675活化MEKK2，导致USP15的募集，USP15进一步从β-catenin中去除泛素，防止其组成蛋白酶产生依赖性周转。区别于经典Wnt刺激通过阻止β-catenin泛素化起作用，但MEKK2途径促进β-catenin去泛素化[17]。虽然MEKK2和Wnt途径似乎是不同的，但是这两个途径均通过逆转或阻止β-catenin的基础泛素化和降解以发挥其促进细胞成骨分化和活性增强作用。MEKK2-Wnt这一分子偶联模型的构建业已被论证和详细阐述，并对骨代谢起着重要作用。

基于上述的分子偶联模型，本研究尝试运用中药复方进行偶联的节点介导，解析“补肾祛湿法”精细化调控MEKK2-Wnt偶联以拮抗GC作用靶点和效用性，并逐步推广于临床实践指导。因此，本实验采用“补肾祛湿法”的经验方FTZ作为干预的中药复方。该中成药主要用于调脂、抑斑块、保护内皮等一系列心血管作用。超剂量GC作用下能够诱导BMSCs 向脂肪细胞分化，增加了脂肪细胞沉积，病理性失调导致机体骨代谢紊乱，进而引发出现成骨细胞凋亡。从中医药的角度，该病机属于“肾虚兼湿邪内阻”，因此采用“补肾祛湿法”是针对GC导致骨代谢紊乱副作用的治法。利用FTZ的效用性在GIOP中精细化MEKK2-Wnt偶联，从而拮抗GC副作用，改善骨微环境的骨脂代谢功能，促进成骨分化和抑制骨丢失，是本项目组根据传统中医药对于FTZ补肾化湿的药效定义，及大量中医药临床实践所提出来的科学假设。

综上所述，本研究从动物实验和细胞培养两个层面观察FTZ对GIOP大鼠的防治作用，同时运用分子生物学技术，明确了FTZ对Wnt/β-catenin信号通路中关键因子MEKK2、Wnt3a、β-catenin等的表达变化，测定成骨分化相关基因ALP、Runx2、OCN表达，并对成骨功能进行初步验证，为临床防治GIOP 的合理用药提供实验依据。

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