ADAMTS-4 在心力衰竭患者心肌中的表达及意义

姜慧敏，王梦龙，刘剑芳，叶晶，徐瑶，王震，万军

慢性心力衰竭（CHF）是指心脏的收缩功能和（或）舒张功能发生障碍，是大多数心脏疾病的终末阶段，可导致严重的并发症，包括恶性心律失常和心源性猝死。研究表明心肌重构在心力衰竭中发挥重要作用。心肌重构包括心肌组织结构、电生理及代谢等方面的改变，其中心肌组织结构改变是心肌重构的一个重要特征，包括心肌细胞凋亡、心肌纤维化等[1]。

ADAMTS即含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶，是继基质金属蛋白酶（MMP）后新发现的一类依赖Zn2+的分泌型金属蛋白酶。通过粘附、细胞融合、信号转导、蛋白水解等作用参与一系列的病理生理过程，包括血管生成、细胞凋亡、肿瘤转移、炎症等[2,3]。有研究表明ADAMTS蛋白家族可调控多种疾病的发展，包括骨关节炎、冠心病、心肌肥厚等[4-6]。

ADAMTS-4是ADAMTS家族中的一员。研究显示，ADAMTS-4与心血管疾病密切相关。Chen等研究发现血清中ADAMTS-4水平与冠心病患者病情的严重程度呈正相关[7]。同时，ADAMTS-4基因敲除小鼠高脂饮食诱导的动脉粥样硬化明显改善，且明显下调血浆促炎因子的水平，提示ADAMTS-4可能通过炎症反应在冠状动脉粥样硬化中发挥作用[8]，但ADAMTS-4在心力衰竭患者中的表达及作用尚不清楚。本研究通过检测心力衰竭患者心肌组织中ADAMTS-4的表达改变，探讨心力衰竭的可能发病机制。

1 材料与方法

1.1 心脏标本收集 收集2012年7月～2017年3月武汉大学人民医院终末期心力衰竭患者心脏移植后的病变心脏及配型不成功的正常供体心脏标本，心力衰竭患者17例，纳入心力衰竭组，男性12例，女性5例，年龄（46.5±9.7）岁，左室舒张末期内径为（67.82±9.25）mm，左室射血分数为（27.35±6.17）%。心力衰竭诊断符合欧洲心脏病协会2012年发布的“急性与慢性心力衰竭的诊断及治疗指南”中的标准[9]。配型不成功的正常供体心脏8例，纳入对照组，均为男性，年龄（37.6±6.9）岁。取左室心尖部心肌组织作为检测样本，心脏离体后立即分离样本，用0.9%生理盐水冲洗后部分置于液氮中速冻，在-80℃的冰箱中保存用于蛋白及mRNA检测，另一部分放入10%中性福尔马林中用于病理学检测。所有标本的收取及处理均取得患者及其家属的知情同意。

1.2 主要实验器材与试剂 实时荧光定量PCR检测仪（Roche，Light Cycler 480）、PCR扩增仪（Thermal Block）、超声裂解仪（Misonix，XL-200）、蛋白/核酸电泳仪（北京六一生物科技有限公司，DYY-6C）、Western-blot电转仪（Invitrogen，XCell SureLock）、转膜槽（北京六一生物科技有限公司，DYCP-31DN）；Trizol、反转录试剂盒购于Roche，anti-ADAMTS-4抗体购于Abcam，anti-GAPDH抗体购于CST公司，常用试剂购于国药公司。

1.3 方法

1.3.1 心肌组织HE染色 苏木精-伊红染色观察心肌组织病理学改变，10%中性福尔马林固定后进行石蜡包埋及切片，常规HE染色，经酒精脱水、二甲苯透明及树脂封片等步骤后使用光学显微镜观察。

1.3.2 天狼星红染色 心肌组织在10%中性福尔马林固定后进行石蜡包埋及切片，将切片置于染色盒中，天狼星红充分染色90 min，经脱水、二甲苯透明及封片等步骤后用光学显微镜拍照，红色为心肌细胞间基质中的胶原，计算胶原容积分数，胶原容积分数=胶原面积/图像面积×100%。1.3.3 实时荧光定量PCR检测 以Trizol法提取心肌组织总RNA，取2 μg总RNA逆转录合成cDNA，采用罗氏Light Cycler 480 Real-time PCR仪进行相应指标的PCR扩增，反应条件为：95℃10 min，95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 20 s，40个循环；72℃ 10 min。GAPDH为内参，以2-△△CT法进行定量分析。ADAMTS-4引物序列：上游5'- ACATTCTTGTCCGGCAGCAG-3'，下游5'-GGAGGGCATCAGCGTGTATT-3'；GAPDH引物序列：上游5'-GGATTTGGTCGTATTGGGCG-3'，下游5'-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3'，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.3.4 蛋白印记检测（Western-blot） 取心肌组织，加入预冷的裂解液充分研磨混匀后进行超声裂解，离心30 min后吸取上清中的总蛋白，以BCA法测定蛋白浓度。制备电泳样品，样品上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上，将膜取出放置在含5%脱脂奶粉的TBS液中封闭1 h，用TBST洗膜，放入一抗中孵育，4℃过夜，洗膜，加入相应种属的二抗孵育1 h，洗膜后加入发光液，凝胶成像系统成像，以GAPDH为内参分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS 18.0软件对数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组均数的比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组心肌组织病理学改变 光镜下，对照组心肌细胞形态完整，胞浆均匀致密，细胞排列整齐，可见清晰的细胞核；心力衰竭组患者心肌细胞肿大，细胞形态不规整，肌丝断裂，细胞排列紊乱，可见畸形、增大的细胞核（图1）。

2.2 两组心肌纤维化程度比较 天狼星红染色显示，心力衰竭组患者心肌组织胶原纤维含量较对照组增多，胶原纤维增粗、排列紊乱，胶原容积分数较对照组升高，（10.18±0.63）% vs. （2.56±0.25）%，差异具有统计学意义（P＜0.01），提示心力衰竭患者心肌组织纤维化、心肌重构明显（图2）。

2.3 两组心肌组织ADAMTS-4 mRNA相对表达水平比较 与对照组相比，心力衰竭组患者心肌组织ADAMTS-4 mRNA相对表达水平明显增高，（1.00±0.03） vs. （1.50±0.03），差异具有统计学意义（P＜0.01）（图3）。

2.4 两组心肌组织ADAMTS-4蛋白表达水平比较 与对照组相比，心力衰竭组患者心肌组织ADAMTS-4蛋白表达水平明显升高，（1.00±0.06） vs. （2.01±0.09），差异具有统计学意义（P＜0.01）（图4）。

3 讨论

图1 对照组与心力衰竭组心肌组织HE染色对比（200×）

图2 对照组与心力衰竭组心肌胶原纤维含量比较

图3 对照组与心力衰竭组ADAMTS-4mRNA相对表达情况

图4 对照组与心力衰竭组ADAMTS-4蛋白表达情况

心肌组织结构重构包括心肌细胞及胞外基质的变化，即心肌细胞凋亡、心肌纤维化等[1]，这一系列变化涉及炎症、氧化应激等[10,11]，而多种炎症介质与心肌结构重构相关，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）等[12,13]。心力衰竭的发生机制目前尚不十分明确，分析心肌重构可为治疗心力衰竭提供参考。

ADAMTS是一种含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的基质金属蛋白酶，能够调控细胞外基质的结构，研究显示，ADAMTS的表达或功能异常与关节炎、癌症及心血管疾病相关[14]。Liu等研究发现大黄素可减轻大鼠肺间质纤维化，同时在使用大黄素后，转化生长因子-β1（TGF-β1）表达下调，而ADAMTS-1表达上调，提示ADAMTS-1通过TGF-β1途径参与大黄素介导的肺间质纤维化减轻[15]。Bukong等发现四氯化碳诱导的小鼠肝脏纤维化模型中，ADAMTS-5、9、15、20的表达均上调，提示这些ADAMTS与纤维化的相关性[16]。

ADAMTS-4属于ADAMTS家族中蛋白聚糖酶亚组，目前认为ADAMTS-4是最有活性的蛋白聚糖酶之一，对维持蛋白聚糖的合成及分解代谢起着重要的作用[17]。研究发现，在脂多糖（LPS）诱导的小鼠心肌纤维化模型中，ADAMTS-4的表达增加，提示ADAMTS-4可能与心肌纤维化相关[18]。Mark等通过基因表达检测技术发现与正常组织相比，特发性肺间质纤维化肺组织中ADAMTS-4的表达发生改变，提示ADAMTS-4与特发性肺间质纤维化相关[19]。另有研究表明巨噬细胞在TNF-α和IL-1β的刺激下合成ADAMTS-4增加[20]，而TNF-α和IL-1β被认为与心肌重构相关，提示炎症因子如TNF-α和IL-1β等可能通过刺激ADAMTS-4表达增加引起心肌重构。

本研究中，心力衰竭患者心肌组织结构紊乱，心脏纤维化程度明显重于正常心脏，心肌组织结构重构明显，并且，ADAMTS-4的mRNA及蛋白相对表达水平均明显高于对照组，提示ADAMTS-4可能在心力衰竭的发生发展中起到重要作用。本研究仅检测了ADAMTS-4在心力衰竭及正常供体心脏中的表达，而表达发生变化的具体机制尚不明确，有待进一步研究。

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