红薯叶总黄酮对小鼠脑缺血缺氧保护作用的研究

杨敏 杨立轩 韦妮 冯洁 郭子鹏 凌秀孟 莫庸 韦金花 王俐 谢尤祥 冯雪萍

【摘要】 目的 探讨红薯叶总黄酮对小鼠急性脑缺血缺氧的作用。方法 制备红薯叶总黄酮溶液，通过饱和MgCl2致小鼠急性脑缺血实验、NaNO2中毒性缺氧实验、常压耐缺氧实验和小鼠断头实验，检测急性脑缺血缺氧小鼠脑组织中总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性和丙二醛 （MDA）含量变化。结果 与正常对照组比较，各给药组小鼠的存活时间均延长，差异有统计学意义（P<0.05或0.01）;各给药组脑指数和MDA含量均下降，T-SOD活性提高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 红薯叶总黄酮溶液对脑缺血缺氧损伤有一定的保护作用。

【关键词】 红薯叶总黄酮;脑缺血缺氧;小鼠;保护作用

中图分类号：R285.5 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.06.002

紅薯味甘，性平，具有补中、益气、健脾、通便等多种功效，是我国主要农作物之一。现代科学研究表明红薯茎、叶中富含各种化学成分，其提取物具有广泛的医疗和保健作用。目前，对红薯叶的研究主要集中在其提取物黄酮化合物及其功能、活性多糖及其功能和红薯叶作为保健食品的开发利用等方面。研究证实，红薯叶黄酮化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抗菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射、治疗腹泻等多重作用[1]。“药食同源”是中医推崇的疾病防治方法，经常食用红薯叶有美容护肤，延年益寿的功效，在欧美、日本等国家及香港地区掀起一股“红薯叶热”，而在国内大部分地区红薯叶却被废弃或作为动物饲料，没有得到充分的利用。因此，对红薯叶进行开发利用具有广阔的市场前景[2]。目前为止尚未发现红薯叶总黄酮对缺血性脑血管疾病的相关研究，本实验通过构建四个经典小鼠急性脑缺血缺氧模型，观察红薯叶总黄酮对脑缺血缺氧的保护作用，并初步探讨其可能的作用机制，为红薯叶的开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器

KQ5200DB型数控超声波清洗器、电热恒温水浴锅、旋转蒸发仪、FSH-2A可调高速电动匀浆机、高速台式离心机、722型分光光度计、FA（N）/JA（N）电子天平。

1.1.2 动物

SPF级昆明小鼠120只[由右江民族医学院动物实验中心提供，许可证号：SCXK（桂）2017-2003，使用许可证号：SYXK（桂）2017-0004]，雄雌各半，体重（20±2）g。小鼠在正式实验前均在SPF级实验室适应性饲养一周，自由采食和饮水。

1.1.3 药品

红薯叶（采摘于广西百色市）;尼莫地平片（四川科伦药业股份有限公司，生产批号：B160309015）;乙醇（分析纯，生产批号：20170115，天津市富宇精细化工有限公司）;钠石灰（生产批号：20170210，上海纳辉干燥试剂厂）;总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定试剂盒（生产批号：20170809）、丙二醛 （MDA）测定试剂盒（生产批号：20170806）和总蛋白测定试剂盒（生产批号：20170809），均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 红薯叶总黄酮的制备

（1）提取：采集新鲜的红薯叶去杂、清水漂洗并沥干其表面水分，（80±1）℃鼓风干燥72 h以上，冷却后粉碎，过40目筛后，置干燥器备用。精密称取红薯叶粉末200 g，加2000 mL 70%乙醇，密闭浸泡过夜，超声波提取2.5 h，抽滤。滤渣再加1500 mL 70%乙醇，超声波提取1.5 h，抽滤，合并两次滤液，旋转蒸发，然后用乙酸乙酯萃取3次，真空干燥，得到红薯叶粗制总黄酮粉末。（2）纯化：将提取得到的粗黄酮化合物在AB8大孔树脂柱上进行纯化，用500 mL 60%乙醇洗脱，收集乙醇部分，减压浓缩，在冷冻机中干燥得到纯化黄酮。（3）鉴定：将纯化后得到的总黄酮取少量溶于1 mL甲醇溶液试管中，加入浓盐酸2～3滴，再加少量镁粉，观察到玫瑰红色即可确定为红薯叶总黄酮。（4）含量的测定：采用以芦丁为标准品的比色法测定总黄酮含量。

1.2.2 小鼠急性脑缺血实验[3]

1.2.2.1 饱和MgCl2致小鼠急性脑缺血实验

SPF级昆明小鼠30只，雌雄各半，体重（20±2）g，随机分成三组：空白组、总黄酮提取组、尼莫地平组;每天灌胃，红薯叶总黄酮提取组和尼莫地平组的给药剂量分别为200 mg·kg-1、18 mg·kg-1，空白组用等量生理盐水灌胃，连续7天，末次给药1 h后，小鼠尾静脉注射饱和MgCl2溶液（0.1 mL·10 g-1），记录存活时间为从注射药品至最后一次张口喘息的时间。

1.2.2.2 4%NaNO2溶液腹腔注射所致小鼠中毒性缺氧实验

SPF级昆明小鼠30只，雌雄各半，体重（20±2）g，分组及给药方法同1.2.2.1，NaNO2给药剂量为（0.1 mL·10 g-1）

1.2.2.3 常压耐缺氧实验

SPF级昆明小鼠30只，雌雄各半，体重（20±2）g，分组及给药方法同1.2.2.1，末次给药1 h后，将小鼠放入装有20 g钠石灰的150 mL的带塞的广口瓶中，记录小鼠从放入瓶中至停止呼吸的时间。

1.2.2.4 小鼠断头实验

SPF级昆明小鼠30只，雌雄各半，体重（20±2）g，分组与操作方法同1.2.2.1，末次给药前称重，给药后1 h，迅速从小鼠耳后颈部断头，记录小鼠张口喘息次数和喘息维持的时间，然后冰上取全脑，计算脑指数。再用9倍4 ℃生理盐水将脑组织匀浆，制成10%匀浆液，离心取上清4 ℃保持备用。

1.2.3 小鼠脑组织中T-SOD和MDA的含量测定

取制备好的脑组织匀浆，参照试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 进行统计学分析，数据以（±s）表示，运用单因素方差分析（LSD 法）进行组间比较，检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 总黄酮的含量测定

2.1.1 标准曲线的绘制

称取芦丁标准品10 mg，溶于100 mL 60%乙醇，分别精密吸取芦丁对照液（0.10 mg·mL-1）0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10.00 mL容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.30 mL，摇匀，静置6 min;再加10%硝酸铝溶液0.30 mL，搖匀，静置6 min;再加4%氢氧化钠溶液4.00 mL，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置12 min，以试剂作空白参比液，于510 nm处测吸光度[4]。以芦丁浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线，得到芦丁溶液浓度（Y）与吸光度值（A）关系曲线的回归方程式：Y=0.1468X+0.0019，绝对系数 R2=0.999。

2.1.2 样品含量的测定

精密称取样品总黄酮10 mg，溶于100 mL 60%乙醇，吸取样品液1 mL，置10 mL容量瓶，60%乙醇补足至刻度，测定吸光度，根据回归方程计算样品中总黄酮的含量为0.5 mg/mL。

2.2 红薯叶总黄酮对3种模型小鼠耐缺氧存活时间的影响

由表1可知，与正常对照组相比，尼莫地平组和总黄酮提取组均能延长饱和MgCl2致小鼠急性脑缺血的存活时间，差异有统计学意义（P<0.05），也能延长NaNO2所致小鼠中毒性缺氧的存活时间，差异有统计学意义（P<0.01）;两个给药组均能显著延长小鼠常压耐缺氧的存活时间，差异有统计学意义（P<0.05或0.01）;尼莫地平组与总黄酮提取组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3 红薯叶总黄酮对小鼠断头喘息的影响

由表2可知，与正常对照组比较，各给药组均能增加小鼠断头后的喘息次数，差异有统计学意义（P<0.01），延长小鼠断头后的喘息维持时间，差异有统计学意义（P<0.01）;尼莫地平组与总黄酮提取组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.4 红薯叶总黄酮对急性全脑缺血缺氧小鼠脑指数及T-SOD和MDA含量的影响

由表3可知，与正常对照组比较，各给药组脑指数和MDA含量均显著下降，SOD活性显著提高，差异有统计学意义（P<0.05）;尼莫地平组与总黄酮提取组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

缺血性脑血管病是危害人类健康的疾病，具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点[5]，发病机制复杂，难治愈，给家庭和社会带来沉重的负担。在脑组织发生缺血和缺氧的情况下，脑细胞会释放大量的炎症因子、兴奋性氨基酸参与组织损伤过程，从而诱发脑功能障碍疾病[6]。脑缺血缺氧是一个复杂的病理过程，需及时进行治疗，否则会导致脑损伤加重甚至死亡。目前治疗缺血性脑损伤，主要是从抗谷氨酸受体、抗钙超载、抗自由基这些途径入手，至今尚无有效的治疗方法[7]。脑缺血缺氧损伤是一个复杂的级联反应，其损伤机制主要与自由基生成增多等因素有关[8]。已证实红薯叶黄酮类化合物是一种很好的自由基清除剂[9]，可以提高老龄糖尿病大鼠的免疫力[10];改善模型动物体重，显著降低内脏脂肪含量和空腹血浆胰岛素水平，对非胰岛素依赖型糖尿病小鼠具有降低血糖、血脂和增加抗氧化性的功能[11]，还可以改善糖尿病小鼠肾脏的损伤，对肾细胞具有良好的保护作用[12]。

当脑组织由于各种原因导致缺血缺氧时，就会产生大量炎症因子，引起脑水肿，进而弱化血脑屏障功能，加速炎症因子进入脑组织，加剧对脑部的损伤[13]。本实验通过几个经典小鼠脑缺血模型检测红薯叶总黄酮对脑的保护作用，结果提示：红薯叶总黄酮可显著延长饱和MgCl2所致急性脑缺血小鼠和NaNO2所致小鼠中毒性缺氧的存活时间，增加断头小鼠喘息次数，延长断头小鼠喘息时间，降低小鼠脑指数和MDA含量，提高T-SOD活性。实验结果说明红薯叶总黄酮对模型小鼠脑缺血后的功能具有一定的维持作用，能显著提高模型小鼠脑组织中T-SOD的活性，降低MDA的含量，并能缓解由于脑组织在急性缺血缺氧的情况下造成的脑组织水肿。各实验组均以尼莫地平作为阳性对照药，结果表明尼莫地平能起到显著缓解脑缺血缺氧的作用，验证了其治疗缺血性脑血管病的药效。两个给药组相比较，红薯叶总黄酮几乎具备与尼莫地平同样的抗脑缺血缺氧的药效，因此可以推测长期食用红薯叶可以达到预防脑血管疾病的目的。

总之，从实验可以看出红薯叶总黄酮具有很强的抗氧化性，可以减轻氧化应激对脑组织造成的损伤，对脑组织具有一定的保护作用，其保护机制可能与黄酮化合物具有直接清除氧自由基活性有关。另外，红薯叶黄酮还是天然食品的提取物兼具无毒无副作用的优点，可以作为天然抗氧化剂来使用。但红薯叶总黄酮对脑缺血缺氧疾病的最大有效给药剂量和具体的作用机制还有待进一步深入探讨。

参 考 文 献

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