PSGL—1+/—；IL—2—/—小鼠模型的构建

杨扬等

[摘要] 目的 构建PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型。 方法 将白介素2敲除（IL-2 KO）小鼠与P-选择素糖蛋白配体-1敲除（PSGL-1 KO）小鼠杂交，剪尾提DNA后用PCR法检测小鼠的基因型。 结果 IL-2 KO小鼠与PSGL-1 KO小鼠杂交三代后，PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型构建成功。 结论 将IL-2 KO小鼠与PSGL-1 KO小鼠杂交三代后，成功建立了PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型。

[关键词] P-选择素糖蛋白配体-1；白介素-2；P-选择素糖蛋白配体-1敲除小鼠；白介素-2敲除小鼠；动物模型

[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）23-0007-03

[Abstract] Objective To construct the PSGL-1+/-；IL-2-/- mice model. Methods PSGL-1 KO mice were mated with IL-2 KO mice. Mice were genotyped by PCR after cut the tail and extracted DNA. Results After PSGL-1 KO mice being mated with IL-2 KO mice for three generations， PSGL-1+/-；IL-2-/- mice were obtained. Conclusion PSGL-1+/-；IL-2-/- mice are established through PSGL-1 KO mice being mated with IL-2 KO mice.

[Key words] PSGL-1；IL-2；PSGL-1 knockout mice；IL-2 knockout mice；Animal model

基因工程小鼠（genetically engineered mouse，GEM）是随着细胞工程、分子生物学的发展，利用基因打靶、转基因、嵌合体等技术对实验小鼠基因组有目的的改造或修饰，使小鼠有特定的特性或生物表型，以研究基因的功能、调控机制及与其他基因的相互作用等[1]。基因工程小鼠还可以作为人类的疾病模型，如自发肿瘤模型、自发动脉粥样硬化模型等，研究疾病的发病机制和药物研究。基因工程小鼠包括基因敲除小鼠、基因替换小鼠和转基因小鼠[2，3]。本实验所用的两种基因工程小鼠为基因敲除小鼠，分别是白细胞介素-2敲除小鼠（IL-2 KO mouse）和P-选择素糖蛋白配体-1敲除小鼠（PSGL-1 KO mouse）。为了进一步研究白细胞介素-2和P-选择素糖蛋白配体-1在炎症、心血管及肿瘤疾病中的共同作用，将IL-2 KO 小鼠和PSGL-1 KO 小鼠杂交建立了PSGL-1基因敲除及IL-2为杂合子的PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型。可以再利用此小鼠模型建立各种炎症、心血管及肿瘤等疾病模型，所以此模型可作为研究PSGL-1和IL-2在炎症、心血管和肿瘤中作用及相互关系的良好动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料来源

1.1.1 实验动物及饲养 P-选择素糖蛋白配体-1敲除小鼠（PSGL-1 KO小鼠）和白介素-2敲除小鼠（IL-2 KO小鼠）购自美国Jackson实验室，共4只，雌雄各2只，周龄6～8周。小鼠在SPF级环境中饲养，动物房温度控制在22℃～28℃，湿度为50%～70%，并且保持12 h明/12 h暗。小鼠的饲料购自广东省医学实验动物中心并经60Co辐照灭菌的全营养饲料。饮用水高压灭菌。实验设计时间为2013年6月～2014年3月。

1.1.2 试剂 PCR引物由广州英骏公司合成，蛋白酶K及dNTP购自Sigma公司，Taq酶、Tris饱和酚及氯仿从广州康龙公司订购。

1.2 方法

1.2.1 IL-2基因的鉴定 突变型IL-2引物的序列：TCG AAT TCG CCA ATG ACA AGA CGC T；野生型IL-2引物的序列：CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT；通用引物序列：GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C。PCR反应条件：94℃变性3 min，94℃ 30 s，64℃ 45 s，72℃ 45 s，35个循环，72℃2 min充分延伸。在500 bp处有一条带为IL-2纯合子的小鼠，在342 bp处有一条带为野生型小鼠，在500 bp和324 bp处各有一条带为杂合子小鼠。

1.2.2 PSGL-1基因的鉴定 野生型PSGL-1基因引物序列：P1：5'-TCAAAA TC GTCATCCCCAAC -3，P2：5'-AGCTTCCTT GTGCTGCTGAC -3''；突变型PSGL-1基因引物序列：P1：5'-CCTT CTAT CGCC TTCT TGA CG-3'，P2：5'-TCAAAA TCGTCA TCCCCAAC-3'。PCR反应的条件：94℃变性5 min，94℃30 s，65℃ 1 min，72℃ 1 min，循环35次；72℃延伸2 min。PSGL-1基因敲除的纯合子小鼠在500 bp处有一条带，PSGL-1基因为杂合子的小鼠在140 bp和500 bp处各有一条带。

1.2.3 PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型的构建 用IL-2 KO 雄性小鼠与PSGL-1 KO雌性小鼠杂交，第一代小鼠PSGL-1和IL-2基因均为杂合子，用PSGL-1+/-；IL-2+/-雄性小鼠与IL-2 KO雌性小鼠或者用PSGL-1+/-；IL-2+/-雌性小鼠与IL-2 KO雄性小鼠再进行杂交，在第二代可得到PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠。endprint

2 结果

2.1 IL-2 KO小鼠与PSGL-1 KO小鼠杂交情况

IL-2 KO 雄性小鼠与PSGL-1 KO雌性小鼠以1∶2的比例杂交两笼，所生小鼠IL-2和PSGL-1基因全部为杂合子，共获得24只。用第一代小鼠与IL-2 KO 小鼠杂交，第二代共获得小鼠136只，其中PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠38只。

2.2 PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠的鉴定结果

把PSGL-1 KO小鼠和IL-2 KO小鼠杂交，在第三代小鼠中，1、3号和4号小鼠为PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠，2号小鼠为PSGL-1+/-；IL-2+/-小鼠。图1A中的5号小鼠为PSGL-1基因的阳性对照，图1B中的5号小鼠为IL-2基因的阳性对照。

3讨论

白介素-2（IL-2）是由Morgan等在1976年发现的由T淋巴细胞分泌的一种因子，主要由活化的Ⅰ型辅助淋巴细胞分泌，主要功能是刺激T细胞的增生，促进T细胞的增殖；还促进NK细胞和B细胞的活化、增殖；促进细胞毒性T淋巴细胞的产生和增殖等[4-6]。白介素-2还可以促使NK细胞、T淋巴细胞产生肿瘤坏死因子和干扰素等，而且目前已广泛应用于抗炎和抗肿瘤治疗[7-10]。

P-选择素糖蛋白配体-1（P-selectin glycoprotein ligand-1， PSGL-1）是一种粘附分子，在几乎所有类型的白细胞表面表达，是选择素的配体[11-14]。因此，PSGL-1与表达于白细胞的L-选择素及表达于活化的血管内皮细胞的E-选择素和P-选择素相互作用，从而介导白细胞的黏附[15，16]。由于白细胞黏附与炎症、凝血、伤口修复及肿瘤转移等密切相关，因此PSGL-1介导的白细胞黏附作用可在多种生理和病理过程中发挥重要的作用。

IL-2敲除小鼠是由Ivan Horak等在1991年构建成功的，IL-2纯合子敲除小鼠在4～9周时会出现脾、淋巴结肿大、肠道炎症及贫血等疾病的症状。由于白介素-2与PSGL-1在炎症、肿瘤等疾病中都发挥重要作用，为了探索两者是否具有协同或拮抗作用，本实验将白细胞介素-2敲除小鼠和黏附分子P-选择素糖蛋白配体基因敲除小鼠杂交建立了PSGL-1基因敲除及IL-2为杂合子的PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型，在饲养的过程中，由于PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠的免疫力会降低，易感染，因此在饲养的过程中对无菌的要求会更加严格，小鼠必须饲养于SPF环境中，饮用水及饲料必须是无菌的。可以利用此小鼠模型建立各种炎症、心血管、自身免疫性疾病及肿瘤模型，也为研究PSGL-1和IL-2在炎症、心血管和肿瘤疾病中的作用及相互关系提供了良好的动物模型。

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（收稿日期：2014-04-14）endprint

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