清脑片对沙鼠脑缺血再灌注模型血浆ET和CGRP含量及脑组织病理变化的影响＊

高延玲，郝少君，谢国旗，王红宇，陈维亮，孔学军，张正臣

脑血管疾病是一种严重危害人类生命健康，影响正常生活的常见病。在我国的疾病死因中一直居于首位，其中缺血性脑卒中约占75%～90%［1］。脑卒中（stroke），中医称为中风，具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点，是当前严重威胁人类健康与生命的主要疾病。中风属于急性脑血管病，可分为出血性脑血管病和缺血性脑血管病。由于缺血性脑卒中的发病率远高于出血性脑卒中，因此，研究和防治缺血性脑卒中，减少死亡率和致残率，已成为当前医学的攻关重点［2］。用于研究脑缺血的动物模型中，沙鼠以其独特脑部构造逐渐成为国内外用于筛选脑保护活性成分或脑保护药物的新兴、主流模型［3］。该文主要观察清脑片对沙鼠脑缺血模型血浆内皮素（endothelin，ET），降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）含量以及对脑组织海马区和皮质区病理变化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 长爪沙鼠，雄性，50～70 g，级别：清洁级，合格证号：1605160013，提供单位：浙江省实验动物中心，许可证号：SCXK（浙）2014-0001。 实验室合格证：SYXK（豫）2015-0005。

1.2 药物试剂 清脑片（白芷、当归、川芎、勾藤、细辛、龙骨、薄荷；功能主治：活血、行气通窍、镇痛、清利头目。用于头痛、头晕、脑震荡后遗症；用法用量：口服，3次/d，3～5片/次），中国人民解放军第三七一中心医院提供。制法：取白芷50 g、当归75 g、川芎75 g粉碎成100目细粉备用。剩余白芷、当归、川芎及其余各味药材粉碎成10目粗粉，加8倍水煎煮两次，首次2 h，二次2 h，合并煎煮液，滤过。滤液浓缩至相对密度1.15～1.30（80℃）。加入上述细粉、淀粉适量，混匀，干燥成干膏，粉碎，用稀糖浆经14～16目筛制粒，50～60℃烘干，用14目筛整粒，加入1%硬脂酸镁混匀，压片（每片0.3 g），包衣，制成1000片即得。中国人民解放军第三七一中心医院提供，生产批号：20141125。

脑络通胶囊，生产厂家：河南辅仁堂制药有限公司；批号：150309。

水合氯醛，郑州派尼化学试剂厂，批号：20150427。

生理盐水，河南双鹤华利药业有限公司生产，批号：13090906B。

Rat ET检测试剂盒，生产厂家：北京诚林生物技术有限公司，批号：E20160501A；CGRP ELISA检测试剂盒，生产厂家：北京诚林生物技术有限公司，批号：E20160501A。

1.3 实验仪器 JM 1000电子秤，余姚记铭称重校验设备有限公司；AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；JZ19600型手动移液器，美国赛默飞世尔科技有限公司；HHS-21-8型电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；BCD-248T型冰箱，新飞电器有限公司；紫外/可见分光光度计，型号：UV1000，上海天美科学仪器有限公司；漩涡混合器，型号：TYXH-1，无锡沃信仪器有限公司；细胞成像微孔板检测仪，型号：CYT3 MFVDG，美国伯腾仪器有限公司。

1.4方 法

1.4.1 造模方法 取体重为50～70 g健康雄性长爪沙鼠60只，随机分为6组，每组10只，分别为假手术组、模型组、脑络通胶囊组及高、中、低剂量清脑片组。正常饲养3 d，开始灌服相应的药物，脑络通胶囊灌服剂量为0.5 g/kg（相当于临床剂量的10倍），高、中、低剂量清脑片组给药剂量分别为1.5 g/kg、0.75 g/kg、0.375 g/kg（相当于临床剂量的20倍、10倍、5倍），假手术组、模型组分别灌服同体积的生理盐水，各组的灌胃体积为1 ml/100 g。给药1次/d，连续给药10 d。于第9天晚上禁食12 h后，最后一次灌胃1 h后，用10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）腹腔注射麻醉沙鼠，待沙鼠进入昏迷状态时，对其进行先结扎双侧颈总动脉10 min，然后再灌注时间为60 min［4］。其中假手术对照组做假手术处理，即只暴露双侧颈总动脉外，其他操作同造模各组。等再灌注时间结束后可迅速用一次性使用静脉采血针直接插入颈总动脉另一侧接入用抗凝管取2 ml左右血液，室温放置约30 min后，4000 r/min离心15 min，取血后立即断头在冰盘中剥离全脑，把脑从矢状线分开成对称的脑，取出海马区，迅速置于10%甲醛溶液中浸泡固定。

1.4.2 检测指标 （1）动脉取血，肝素抗凝后4000 r/min离心15 min取血浆，测血浆中ET，CGRP含量。（2）脑组织切片的形态学评估：用4%缓冲甲醛溶液固定脑组织切片；石蜡包埋脑组织并切成4 μm厚的切片；切片用HE染色并评估脑组织形态学改变。

2 结果

2.1 清脑片对沙鼠脑缺血模型血浆中ET、CGRP含量的影响 与假手术组相比，模型组可显著升高血浆中ET含量 （P＜0.01），显著降低血浆中CGRP水平（P＜0.01），提示沙鼠脑缺血再灌注模型造模成功。与模型组相比，高、中剂量清脑片组和脑络通胶囊组可显著降低血浆中ET含量（P＜0.01）；高剂量清脑片组和脑络通胶囊组可显著升高血浆中CGRP含量（P＜0.01），中、低剂量清脑片组可明显升高血浆中 CGRP 含量（P＜0.05）。 见表 1。

表1 清脑片对沙鼠脑缺血模型血浆中ET、CGRP含量的影响（x±s）

2.2 清脑片对沙鼠脑缺血模型脑组织海马区的病理变化 对脑缺血再灌注模型沙鼠脑组织海马区组织病理观察如下（图1～6）：假手术组：沙鼠海马区组织结构完整，神经元密集、排列规则，胞质丰富，核仁明显；模型组：海马区神经元细胞稀疏，排列不规则，大部分细胞胞浆淡染，胞核皱缩，梗死面积较大；脑络通胶囊组：大部分海马区神经元细胞排列规则，少数神经元坏死；清脑片用药组：大部分海马区神经元细胞排列规则，少数神经元坏死，海马区结构清晰基本正常，梗死面积减少，具体病理分级见表2。

图1 假手术组海马区（HE×400）

图2 模型组海马区（HE×400）

图3 脑络通胶囊组海马区（HE×400）

图4 高剂量清脑片组海马区（HE×400）

图5 中剂量清脑片组海马区（HE×400）

图6 低剂量清脑片组海马区（HE×400）

表2 清脑片对沙鼠脑缺血模型脑组织海马区病理改变的影响

经Ridit检验，与假手术组相比，模型组脑组织海马区出现了显著的病理学变化（P＜0.01），说明脑缺血再灌注模型造模成功。与模型组相比，高剂量清脑片组及脑络通胶囊组可显著改善沙鼠脑组织海马区病理损伤（P＜0.01），中、低剂量清脑片组可明显改善沙鼠脑组织海马区病理损伤（P＜0.05）。

2.3 清脑片对沙鼠脑缺血模型脑组织皮质区的病理变化 对沙鼠脑缺血模型脑组织皮质区组织病理观察如下（图7～12）：假手术组大脑皮质无水肿，神经元密集、排列规则，胞质丰富，无明显水肿；模型组大部分神经元坏死，神经元细胞溶解消失或见少量固缩核残留；脑络通胶囊组大脑皮质区梗死范围缩小，少数神经元坏死，神经元较密集，胞质较丰富，皮质区呈点状梗死；清脑片用药组大脑皮质区较缺血组再灌注组梗死范围缩小，神经元细胞溶解和固缩数量显著减少，水肿程度显著减轻，具体病理分级参见表3。

图7 假手术组皮质区（HE×400）

图8 模型组皮质区（HE×400）

图9 脑络通胶囊组皮质区（HE×400）

图10 高剂量清脑片组皮质区（HE×400）

图11 中剂量清脑片组皮质区（HE×400）

图12 低剂量清脑片组皮质区（HE×400）

表3 清脑片对沙鼠脑缺血模型脑组织皮质区病理改变的影响

经Ridit检验，与假手术组相比，模型组脑组织皮质区出现了显著的病理学变化（P＜0.01），说明复制脑缺血再灌注模型成功。与模型组相比，高剂量清脑片组及脑络通胶囊组可显著改善沙鼠脑组织皮质区病理损伤（P＜0.01），中、低剂量清脑片组可明显改善沙鼠脑组织皮质区病理损伤（P＜0.05）。

3 讨论

脑卒中属于常见的急性多发病，与恶性肿瘤、心脏病构成三类严重威胁人类生命的重大疾病［5］。我国属于脑卒中的高发地区，据流行病学统计，我国每年患脑卒中约600万人，死亡近100万人，在幸存者中约3/4的患者留下偏瘫等后遗症状，部分患者丧失劳动能力和生活能力［6］。中医学认为，脑缺血属于“缺血中风”的范围，血瘀是缺血性中风的常见原因［7］。现代医学认为脑缺血的病因和发病机制倾向于微血栓和血流动力学、血液流变性障碍。这与中医的“血瘀”观是一致的，血瘀是脑缺血的病理基础，血瘀导致了血栓形成［8］。

用于研究脑缺血的动物模型较多，其中沙鼠因大脑基底动脉环先天性发育不完全而成为脑缺血研究的较理想模型，沙鼠脑缺血模型在研究单侧脑缺血和全脑缺血方面都具有独特的优势，在研究脑缺血后脑区的病理变化、再灌注损伤机制及开发脑保护药方面都得到十分广泛的应用［9］。该实验选用血浆中ET、CGRP含量作为指标。ET是目前最强的内源性血管收缩因子，局部缺血的脑组织在缺血期，ET的基因表达呈显著的进行性增强，ET增高可增加脑组织内水、钙含量，加重脑组织缺血及神经元损伤［10，11］。 CGRP 在体内主要分布于神经系统、心血管系统和肺组织，在血管系统，几乎所有的血管床均有CGRP的神经纤维分布，CGRP是体内已知最强的舒血管物质，是ET的内源性拮抗剂，CGRP能有效地防治组织的缺血－再灌注损伤［12］。

脑缺血再灌注损伤主要是指由于脑缺血导致的脑细胞损伤，而恢复血液再灌注后，其缺血性损伤反而会进一步加重。脑组织血流供应中断后引起的一系列缺血级联反应以及再灌注损伤，会影响脑缺血患者结局的重要环节，也是临床治疗的难点。与其他器官相比，脑每时每刻需要充足的含氧血为其供应能量。动物实验发现，血管没发生收缩时就会出现意识障碍，脑血流完全停止即可产生不可逆损伤。缺少血液供应的脑组织可发生缺血性坏死或梗死，当缺血情况严重或持续时间较长时，也会产生局灶性或弥散性缺血改变，并进一步损害神经功能。该实验选择脑络通作为阳性对照药，因脑络通胶囊为处方类心脑血管类药，具有扩张血管、增加脑血流量作用，临床用于脑血栓、脑动脉硬化、中风后遗症等各种脑血管疾病气虚血瘀证引起的头痛、眩晕、半身不遂、肢体发麻、神疲乏力等症，且临床效果明显，作用显著。

该实验研究表明，高、中、低剂量清脑片组可显著降低血浆中ET含量，升高血浆中CGRP含量，可显著改善沙鼠脑组织、海马区皮质区病理损伤。提示ET和CGRP参与脑缺血、脑水肿的病理生理过程。口服清脑片能显著降低急性脑缺血后沙鼠血浆中ET的含量，升高CGRP的含量，改善脑血流，减少脑组织内水、钙含量，减轻脑组织缺血及神经元损伤，从而达到醒神通络、温经祛瘀的作用，可能是治疗急性脑缺血再灌注的重要机理之一。

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