人参皂苷Rh1与Rg1对脂肪细胞增殖分化的影响比较

白音扎布，白长喜

人参作为药中之王，是常用的一味名贵中药材。人参皂苷Rg1在人参或三七根茎中含量较为丰富，对人体具有广泛的药理活性[1]。Rg1经化学降解或经肠道菌群代谢后，可得到人参皂苷Rh1[2]。在糖脂代谢方面，Rg1具有降低血糖、抑制脂肪细胞分化等作用[3]，但对于Rh1是否具调节糖脂代谢作用却研究甚少。本研究以Rh1与Rg1干预3T3-L1小鼠前脂肪细胞（简称3T3-L1细胞）的增殖与分化，比较两者对细胞功能的影响，并探讨其初步机制，为进一步研究人参皂苷Rh1调节糖脂代谢作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料实时荧光定量PCR仪（Applied BiosysStems），酶标检测仪（北京普朗）；3T3-L1细胞系购自ATCC细胞库；人参皂苷Rg1、Rh1（纯度均大于98%，购于成都普思生物）；细胞培养所需培养基均购自Hylone，血清均购自GIBCO公司；噻唑蓝（MTT）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）等诱导剂购自Sigma公司；BCA蛋白定量试剂盒、化学发光试剂盒购自于Sigma公司，逆转录试剂盒购自日本Takara。

1.2 实验方法

1.2.1 MTT比色法分析Rh1和Rg1对3T3-L1细胞增殖的影响在恒温37℃、5%CO2条件下，3T3-L1细胞以含10%的NCBS培养基培养，传代接种于96孔板中，调节细胞计数至4000～5000个/孔，每孔加入120 μl的含药或空白培养基孵育细胞。实验设药物组（分别含Rh1 25、50、100 μmol/L）、对照组（分别含Rg1 25、50、100 μmol/L）及空白组（药物浓度0 μmol/L），每组药物设6个平行对照孔，另设调零孔。分别在药物孵育细胞24、48、72 h后，加入噻唑蓝，继续孵育2 h，加入DMSO振摇，MTT比色法检测各孔光密度值（OD）值。

1.2.2 油红染色测定Rh1和Rg1对3T3-L1细胞分化的影响以含10%FBS的DMEM作为基础培养基培养细胞，将处于对数生长期的3T3-L1细胞接种于96孔板中，移液器换液至细胞单层生长铺满孔底。继续接触抑制2 d后，采用鸡尾酒法开始诱导分化，直至细胞分化为成熟的脂肪细胞。在诱导分化的开始，即加入不同浓度的药物（同上）孵育细胞，并设置相应浓度的对照组及空白组。在细胞分化的第8 d(细胞已分化成熟)，弃去细胞培养液，进行油红O染色分析。

1.2.3 RT-PCR测定Rh1和Rg1对细胞PPARγ和脂联素基因表达的影响细胞药物处理同前，并设空白组。在细胞诱导分化成熟后（第8 d），收取细胞，Trizol法提取成熟脂肪细胞内总RNA，将RNA稀释至1 μg/μl，配置逆转录反应体系，合成cDNA第一链。按逆转录试剂盒说明配置反应体系，进行PCR扩增。反应引物序列是：Adiponectin上游：5'-GTTGCAACCTCTCCTGTTGC-3'，下游：5'-TCTCCAG GAGTGCCATCTCT-3'；PPARγ上游：5'-GGAAGACC ACTCGCATTCCTT-3'，下游：5'-GTAATCAGCAACCA TTGGGTCA-3'；β-actin上游：5'-TGCCGAAGATGACG TTACTACAA-3'，下游：5'-CCCCGTGGCCCTTCAGCT C-3'。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪成像并计算PPARγ以及脂联素mRNA相对于空白组的相对表达量。

1.2.4 Western blot法测定Rh1和Rg1对细胞PPARγ和脂联素蛋白表达的影响如前处理细胞，并设空白组。细胞分化成熟后（第8 d），取裂解细胞低温离心，制作标准曲线并测定样品蛋白含量。将细胞样品蛋白加入电泳槽内电泳、转膜。转膜完成后，PVDF膜在稀释的一抗孵育液中缓慢摇动过夜。次日浸没于二抗孵育液中，室温孵育1 h后化学发光。Western blot测定结果用Quantity One软件分析，结果用PPARγ蛋白或脂联素蛋白与β-actin的灰度值之比表示。

1.3 统计学方法应用SPSS19.0统计软件包进行数据统计分析，实验数据以x±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人参皂苷Rh1和Rg1对3T3-L1细胞增殖影响与空白组相比，50和100 μmol/L的Rh1和Rg1均对3T3-L1细胞有显著的促增殖作用。而Rh1与Rg1相比，中高浓度下，Rh1对细胞的促增殖作用更显著（P＜0.05，表1）。

2.2 人参皂苷Rh1和Rg1对3T3-L1细胞分化的影响3T3-L1细胞经过诱导分化为成熟的脂肪细胞过程中，细胞形态逐渐由长梭形变为椭圆形，并内含脂肪滴。诱导8 d后收取细胞进行油红染色，可见戒环状红色圆点（图1）。与空白组比较，50和100 μmol/L的Rh1和Rg1均显著抑制3T3-L1细胞的脂肪聚集；与Rg1比较，Rh1的抑制作用更强（P＜0.05）。

2.3 人参皂苷Rh1和Rg1对3T3-L1细胞PPARγ和脂联素基因表达的影响灰度分析结果Rh1和Rg1干预细胞诱导分化8 d后，均抑制PPARγ mRNA的表达，而上调脂联素mRNA的表达。与Rg1相比，在50、100 μmol/L浓度下，Rh1对PPARγ的mRNA表达的抑制作用更明显（P＜0.05），分别下调32.48%、58.67%；Rh1对脂联素mRNA表达促进作用更明显（P＜0.05），分别上调49.08%、106.01%。见表2。

表1 人参皂苷Rh1和Rg1对3T3-L1细胞增殖的影响

图1 人参皂苷Rh1和Rg1对3T3-L1细胞成脂分化的影响

表2 Rh1和Rg1对3T3-L1细胞基因表达的影响（n=6）

2.4 人参皂苷Rh1和Rg1对3T3-L1细胞PPARγ和脂联素蛋白表达的影响Western blot结果，人参皂苷Rh1和Rg1在50、100 μmol/L浓度下，均显著抑制PPARγ的蛋白表达，而增加细胞内脂联素的蛋白表达，且Rh1作用均强于Rg1（P＜0.05）。见表3。

表3 Rh1和Rg1对3T3-L1细胞蛋白表达的影响(n=6）

3 讨论

脂肪组织与人类肥胖、Ⅱ型糖尿病等多种疾病的发生息息相关，有研究表明，脂肪细胞过度肥大是导致脂肪组织代谢异常的主要原因[4]。3T3-L1细胞在形态变化、脂质聚集以及转录因子表达等方面都能充分展示脂肪组织的特点。因此，成为国际上公认的研究糖脂代谢的模型细胞[5]。研究表明，PPARγ在高血脂、动脉粥样硬化、Ⅱ型糖尿病、肥胖症等多种疾病的发生发展中，起关键的调节作用[6]。目前，普遍认为人参皂苷Rg1具有调节糖脂代谢作用，但其作用机制不甚明确，Koh等[7]认为Rg1能抑制PPARγ、C/EBPs等转录因子的基因表达，并且增加活性氧簇的表达，从而影响3T3-L1细胞脂肪聚集。Sung等[8]研究表明，人参皂苷Rg1通过AMPK的激活，抑制肝癌细胞中葡萄糖的产生。而Rh1作为Rg1的主要代谢产物，是否具有调节糖脂代谢的药理活性，其作用机制与Rg1是否相同，成为本实验关注的焦点。

本研究结果表明，Rh1作为Rg1的代谢产物，在中高浓度时，更能促进3T3-L1细胞的增殖。Kim等[9]研究表明，Rg1在高浓度时，对细胞产生毒性作用（抑制细胞增殖）；而Rh1在高浓度时，仍然促进细胞增殖，提示其生物毒性更小。Rh1和Rh1对PPARγ的基因与蛋白的表达均呈现出下调作用，且Rh1在中高浓度下作用更强。这与其抑制细胞分化的作用相一致，本研究可以推测，Rh1可通过下调PPARγ的基因表达，减少PPARγ所介导的脂肪聚集，对改善由于PPARγ受体过度上调和激活带来的体重增加有一定作用。

人参皂苷Rh1对3T3-L1细胞的促增殖作用以及抑制分化作用都强于Rg1，且Rh1能显著下调细胞内PPARγ基因和蛋白的表达，并促进脂联素基因和蛋白的表达，推测Rh1可能改善糖脂代谢紊乱，有待进一步深入研究。

[1]尚文斌,杨颖,陈名道.人参及其主要成分抗糖尿病作用机制[J].国际内分泌代谢杂志,2007,27(2):115-117.

[2]陈声武,王岩,王毅,等.人参皂苷Rg1和Rh1抗肿瘤作用的研究[J].吉林大学学报(医学版),2003,29(1):25-28.

[3]盖鑫,弓晓杰,鲁明明,等.人参治疗糖尿病有效成分研究[J].长春中医药大学学报,2013,29(3):539-540.

[4]刘菲,舒丽,胡湘南,等.吡格列酮衍生物CQMUHS-03对3T3-L1细胞增殖分化的影响[J].中国药理学通报,2014,30(1):66-71.

[5]Poulos SP,Dodson MV,Hausman GJ.Cell line models for differentiation:preadipocytes and adipocytes[J].Experimental Biology and Medicine,2010,235(10):1185-1193.

[6]Robinson E,Grieve DJ.Significance of peroxisome proliferator-activated receptors in the cardiovascular system in health and disease[J].Pharmacol Ther,2009,122(3):246-263.

[7]Koh EJ,Hui JJ,Min JS,et al.Panaxsaponin Rg1 inhibits lipid accumulation and ROS production in 3T3-L1 cellsduring adipogenesis[M].2014 International Symposium and Annual Meeting,2014(10):345.

[8]Sung Jip Kim,Hai Dan Yuan,Sung Hyun Chung.Panaxsaponin Rg1 suppresses hepatic glucose production via AMP-Activated protein ki-nase in hepG2 cells[J].Biological&Pharmaceutical Bulletin,2010,33(2):325.

[9]Kim KJ,Koh EJ,Jia C,et al.Panaxsaponin Rg1 suppresses early stageofadipocytedevelopmentviaactivationofC/EBP homologous protein-10 in 3T3-L1 and attenuates fat accumulation in high fat diet-induced obese zebrafish[J].Journal of Ginseng Research,2015,39(5):15.