PPENK-MIDGE-NLS后处理对大鼠心肌缺血再灌注时线粒体的影响

王艳，韩瑞丽，姜静，姚立农

有较多研究表明，脑啡肽-δ受体系统对线粒体有影响，本课题组前期已成功构建前脑啡肽原PPENK-MIDGE-NLS基因载体，并证实该载体预处理能够转染心肌细胞、白细胞，并利用转染后白细胞聚集于心肌缺血再灌注损伤后缺血区的特性，提高局部前脑啡肽含量，产生心肌保护效应[1-2]。本实验旨在进一步研究PPENK-MIDGE-NLS基因载体后处理对大鼠心肌缺血再灌注时线粒体的影响，探索脑啡肽心肌保护新方法，并阐明其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组成年雄性Sprague-Dawley大鼠40只，体重250～300 g，由第四军医大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（军）2012-0007。适应性喂养1 w，心电图检查及体温正常。随机分为假手术组（sham组，n=10）：开胸不阻断冠状动脉左前降支（LAD）血流，经股静脉注射生理盐水1.5 ml；缺血再灌注组（I/R组，n=10）：阻断LAD 30 min，再灌注前给予生理盐水1.5 ml；PPENK-MLDGE-NLS载体组（PPENK组，n=10）及Control-MIDGE-NLS载体组（control组，n=10）：均阻断LAD 30 min，再灌注前分别经股静脉注射PPENK-MIDGE-NLS基因载体200 μg/1.5 ml及control-MIDGE-NLS基因载体200 μg/1.5 ml。

1.2 主要仪器及药品参考文献[3-4]，利用MIDGE方式构建绿色荧光蛋白（GFP）标记的前脑啡肽原基因载体（PPENK-MIDGE-NLS）以及不携带前脑啡肽原基因载体（control-MIDGE-NLS）；戊巴比妥钠（美国Sigma公司）；大鼠cTnI ELISA试剂盒（上海西唐生物有限公司）；组织线粒体分离试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）、ATP检测试剂盒、脂质氧化(MDA)检测试剂盒、SOD活性检测试剂盒均来自碧云天生物技术公司。

1.3 动物模型建立各组大鼠术前12 h禁食过夜，自由摄水。腹腔注射1%戊巴比妥40 mg/kg麻醉，气管插管，正压通气，参数：吸氧浓度33%，吸呼比1∶1，频率75～80次/min，潮气量2～3 ml/kg，常规记录肢体Ⅱ导联心电图。分离大鼠右侧股静脉，置入聚乙烯管。左心耳下缘3～4 mm处穿线结扎阻断左冠状动脉前降支（LAD）血流30 min，各组给药后松开丝线恢复血管再灌注。再灌注24 h后，取标本测相关指标。缺血模型建立成功标志：心外面发白，心电图表现为ST段抬高和(或)T波高耸或弓背向上抬高；再灌注损伤标志：心外膜恢复红润，ST段逐渐下降或T波恢复。

1.4 观察指标

1.4.1 基因载体转染后缺血再灌注后心肌组织表达PPENK-MIDGE-NLS基因载体是以增强型绿色荧光蛋白pEGFP-N1为载体，PCR扩增前脑啡肽原PPENK基因后的重组质粒，绿色荧光蛋白表达间接反映基因载体转染后前脑啡肽PENK蛋白表达情况。取左心室前壁缺血区制作冰冻切片，激光共聚焦显微镜下观察并摄像。

1.4.2 基因载体转染后缺血区脑啡肽含量测定取左室前壁心肌组织，预冷PBS清洗后冰上剪碎，混入3倍体积50%乙酸，100℃水煮沸10 min，4℃2000 r/min离心30 min，取上清液，采用放免法测定缺血区心肌组织亮氨酸-脑啡肽（L-ENK）含量。

1.4.3 血浆cTnI浓度测定分别取4组大鼠血液3 ml，4℃3000 r/min离心15 min分离血浆，-80℃冰箱冻存。采用OlympusAu2700全自动生化分析仪，用cTnI测定试剂盒检测血浆cTnI浓度。

1.4.4 心肌MDA和SOD浓度检测取左室前壁心肌组织制成10%组织匀浆，-80℃冰箱保存待测。采用化学比色法测定MDA和SOD含量。

1.4.5 线粒体膜电位检测取左室前壁心肌组织，预冷PBS清洗后剪碎匀浆（0～4℃），按照组织线粒体分离试剂盒（中国碧云天公司）说明流程提取高纯度线粒体，按线粒体膜电位检测试剂盒（中国碧云天公司）说明书，用荧光酶标仪扫描检测聚合体（激发波长525 nm，发射波长590 nm）与单体（激发波长490 nm，发射波长530 nm），以红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的程度。

1.4.6 心肌组织ATP含量测定取左室前壁心肌组织，按100～200 μl/20 mg加入组织裂解液，匀浆裂解后，4℃120 00 r/min离心5 min，取上清，按ATP检测试剂盒（中国碧云天公司）说明，荧光分光光度计检测心肌组织ATP浓度。

1.4.7 心肌细胞超微结构的观察取左室前壁缺血区大小约1 mm×1 mm×1 mm左心室组织，2%戊二醛固定，漂洗、固定、脱水、包埋、切片、染色后，日立HT7700型透射电子显微镜下，观察心肌细胞超微结构。

1.5 统计学方法应用SPSS 13统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，行单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验；对不满足正态和方差齐性条件的，组内及组间采用Kruskal-Wallis H检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PPENK-MIDGE-NLS基因载体转染后在缺血再灌注后心肌组织表达静脉注射PPENK-MIDGENLS基因载体，并再灌注损伤24 h后，可见转染后缺血区呈现绿色荧光表达。而control组心肌组织切片中未见绿色荧光蛋白的表达。见图1。

2.2 基因载体转染后缺血区亮氨酸脑啡肽含量 缺血再灌注24 h后，与sham组相比，I/R组、PPENK组及control组心肌缺血区L-ENK含量明显下降（P＜0.05）。静脉注射PPENK-MIDGE-NLS基因载体后，PPENK组相较I/R组，L-ENK含量升高（P＜0.05）。而control组较I/R组L-ENK含量无明显统计学差异（P＞0.05）。见图2。

图1PPENK-MIDGE-NLS基因载体转染后在缺血再灌注后心肌组织表达

图2 各组大鼠缺血区亮氨酸脑啡肽含量

2.3 血浆cTnI及心肌组织MDA、SOD含量再灌注损伤后24 h，I/R组血浆cTnI浓度较sham组明显升高（P＜0.05)，而PPENK组血浆cTnI的含量较I/R明显降低（P＜0.05），control组与I/R组无统计学差异（P＞0.05）。再灌注损伤后，I/R组、PPENK组、control组的MDA含量明显高于sham组，SOD含量明显低于sham组（P＜0.05）；PPENK组的MDA含量明显低于I/R组，SOD含量明显高于I/R组（P＜0.05）；control组MDA含量及SOD组与I/R组比较无统计学意义（P＞0.05）；control组MDA含量明显高于PPENK组，SOD含量明显低于PPENK组（P＜0.05）。见表1。

2.4 线粒体膜电位及心肌组织ATP含量测定缺血再灌注损伤24 h后，I/R组、PPENK组、control组缺血区心肌线粒体膜电位及心肌ATP含量均较sham组明显下降（P＜0.05）；PPENK组较I/R组线粒体膜电位升高约20.69%（P＜0.05），心肌缺血区组织ATP含量升高11.68%（P＜0.05）；Control组线粒体膜电位及心肌组织ATP含量与I/R组比较无统计学差异（P＞0.05）。见图3。

2.5 各种心肌细胞及线粒体超微结构改变sham组心肌细胞肌原纤维规整，细胞结构完整；线粒体排列整齐，膜完整，基质密度适中，偶可见线粒体肿胀及嵴突紊乱；I/R组肌原纤维紊乱、断裂，线粒体肿胀,基质密度降低，嵴突紊乱，可见大量空泡化线粒体；PPENK组肌束基本完整，线粒体轻度肿胀,基质基本完整，颗粒部分消失，少部分断裂，可见散在线粒体空泡化分布；control组超微结构改变与I/R组相似（图4）。

3 讨论

本实验观察到大鼠心肌缺血再灌注损伤模型再灌注24 h后，心肌缺血区L-ENK含量下降约59%，并伴随着血浆cTnI浓度升高，表明内源性ENK浓度的减少在缺血再灌注损伤过程中具有重要意义。本研究旨在寻找增加缺血区局部脑啡肽含量，从而改善心肌缺血再灌注损伤的新方法。

实验探讨PPENK-MIDGE-NLS基因载体后处理后24 h对I/R的作用，结果发现，静脉注射PPENKMIDGE-NLS基因载体200 μg后，PPENK组可见缺血区大量绿色荧光表达，提示PPENK-MIDGE-NLS基因载体对心肌细胞具有转染作用。相较I/R组PPENK组L-ENK含量增加，提示PPENK-MIDGENLS基因载体转染后能提高缺血区心肌细胞L-ENK含量。同时心肌损伤指标cTnI含量改善，提示基因载体PPENK-MIDGE-NLS后，可以通过提高缺血区局部脑啡肽含量，减轻心肌损伤。

表1 缺血30min再灌注24h后各组血桨cTnl及心肌MDA、SOD含量的变化(n=10）

图3 各组心肌缺血区线粒体膜电位及心肌组织ATP含量比较

图4 各组电镜下心肌细胞及线粒体超微结构改变

脑啡肽在缺血性疾病（如心肌缺血再灌注损伤、失血性休克等）中表现出明显的保护作用。本实验观察到，给予PPENK-MIDGE-NLS基因载体后24 h，缺血区心肌组织氧化应激损伤减轻，心肌损伤程度降低；并通过对线粒体功能及形态评估，发现给予基因载体能够维持再灌注损伤后线粒体膜电位、提高心肌组织ATP含量，改善线粒体损伤程度。而PPENK-MIDGE-NLS载体可能通过以下作用机制，保护线粒体结构及功能的完整，产生心肌保护效应：增加局部心肌脑啡肽含量，诱导类冬眠作用，减轻心肌氧化应激反应，保存能量，减轻因能量缺乏导致的线粒体崩解或凋亡；抑制线粒体膜通透性转换孔的开放，维持线粒体结构与功能完整[5]。

本实验证实，静脉注射200 μg PPENK-MIDGENLS基因载体后，能够提高缺血区局部脑啡肽含量，减轻缺血区心肌氧化应激反应，改善心肌细胞及线粒体结构，起到心肌保护作用。此为改善心肌缺血再灌注损伤提供了新思路，但仍需进一步深入研究。

[1]陈曦,徐学敏,姚立农,等.PPENK-MIDGE-NLS基因载体的构建及其在活体大鼠的表达[J].生物工程学报,2015,31(2):258-268.

[2]姜静，韩瑞丽，陈曦,等.前脑啡肽原基因转染对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响[J].国际麻醉学与复苏杂志,2017,38(5):390-396.

[3]宋丽华,张晓一,来丽娜,等.白藜芦醇对心肌缺血再灌注过程中线粒体的保护[J].中国医院药学杂志,2015,35(10):907-911.

[4]贺永贵,李王芳,伊红丽,等.黄芪甲苷抑制GSK-3β活性介导大鼠心肌缺血/再灌注损伤作用的线粒体机制研究[J].中国药理学通报,2014,30(3):402-406.

[5]樊海龙,赵凌,任玉兰,等.针灸防治心肌缺血再灌注损伤的线粒体通路研究进展[J].世界中医药,2015,10(4):294-298.