高效液相色谱-串联质谱法测定豆芽中6种植物生长调节剂的残留

2018-03-02叶佳明钟世欢詹越城陈青俊

农产品加工 2018年4期

叶佳明，王京，钟世欢，詹越城，杨琳，陈青俊

（1.浙江公正检验中心有限公司，浙江杭州 310009；2.赞宇科技集团股份有限公司，浙江杭州 310009）

0 引言

豆芽是日常生活中一种价廉物美的食品，富含膳食纤维、蛋白质、B族维生素和微量元素，营养价值丰富且易于被人体消化吸收[1]。近年来，问题豆芽屡有报道，主要由一些小作坊在生产过程中违法添加植物生长激素所致，其中常用的植物生长调节剂有6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠、吲哚乙酸、吲哚丁酸、1-奈乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸、赤霉素、4-氟苯氧乙酸等[2]。这些植物生长调节剂的主要作用是促进豆芽生长、抑制长根和提高产量，长期食用含过量植物生长调节剂的食品会对人体造成积蓄危害[3]。

目前，针对豆芽中6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、赤霉素、吲哚乙酸、吲哚丁酸的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、拉曼光谱法[4]、离子色谱法、气相色谱-质谱法（GC-MS）[5]、气相色谱串联质谱法（GC-MS/MS）[3]、高效液相串联质谱法（HPLC-MS/MS）[6-8]。高效液相色谱法和气相色谱法灵敏度低、易受干扰，拉曼光谱法和离子色谱法使用范围窄，气相色谱-质谱法与气质联用法前处理要求高、样品基质干扰大，吲哚乙酸与吲哚丁酸回收率低[3]。高效液相色谱串联质谱法因其特异性强、灵敏度高、定性能力好，广泛应用于各种禁限用物质的检测。

试验根据豆芽生长激素的化学性质，采用1%酸化乙腈溶液提取，以HLB柱净化，高效液相色谱-串联质谱法测定豆芽中6种生长调节剂，方法简单、快速、高效。

1 试验部分

1.1 试验仪器和试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪、Agilent 6460型三重四级杆串联质谱仪、AR2140型电子分析天平、IKAVORTEXGENIU3型涡旋混合器、TGL-16G型台式离心机、KS-300EI型超声波仪，氮吹仪。

甲醇（色谱级），乙腈（色谱级），4-氯苯氧乙酸（Sigma，纯度98%），4-氟苯氧乙酸（Certificate，纯度98%），6-苄基腺嘌呤（Dr.Ehrenstrfer，纯度99%），赤霉素（Dr.Ehrenstrfer，纯度99%），吲哚乙酸（Dr.Ehrenstrfer，纯度99%），吲哚丁酸（Dr.Ehrenstrfer，纯度99%），OasisMAX固相萃取柱（60mg/3mL，3 μm），Oasis HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL，3 μm），QuECh-ERS粉末（含300 mg无水硫酸镁和100 mg C18和100 mg PSA）。

6种化合物标准溶液的配制：精确称取10.0mg的标准品，用甲醇定容至100 mL，质量浓度为100 μg/mL，使用时用空白基质提取液配置成不同浓度标准工作液。

1.2 试验方法

（1）提取。称取5.0 g样品于50 mL离心管中，加入15 mL 1%酸化乙腈溶液，2 g氯化钠，涡旋1 min后，超声提取20 min，以转速4 000 r/min离心5 min，收集上清液，沉淀加入15 mL 1%酸化乙腈溶液重复提取1次，合并2次提取液。

（2）净化。①取4 mL提取液置于QuEChERS离心管（含300mg无水硫酸镁和100 mg C18和100 mg PSA）中，涡旋混合2 min，以转速4 000 r/min离心5 min，移取全部上清液于15 mL离心管中，于40℃下氮气吹干，加入1 mL流动相定容，过0.22 μm滤膜后，待测。②取2 mL提取液40℃下氮吹，加入3 mL蒸馏水溶解后过HLB小柱，使用前依次用3 mL甲醇，3 mL水活化，用3 mL水淋洗，用3 mL甲醇洗脱，收集洗脱液40℃下氮气吹干，加入1 mL流动相定容，过0.22 μm滤膜后，待测。③取2 mL提取液过MAX小柱，使用前依次用3 mL甲醇，3 mL水活化，依次用3 mL 0.05 mol/L氢氧化钠水溶液，3mL甲醇淋洗，用3 mL 1%甲酸甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃下氮气吹干，加入1mL流动相定容，过0.22 μm滤膜后，待测。

（3）色谱条件。色谱柱：Agilent SB C18，RRHD 1.8 μm，2.1×100 mm；流动相：0.1%甲酸5 mmol/L乙酸铵水溶液和乙腈，梯度洗脱条件见表1；流速0.3 mL/min；柱温30℃；进样量5 μL。

梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

（4）质谱条件。电喷雾ESI离子源：6-苄基腺嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丁酸采用正离子扫描模式；4-氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、赤霉素采用负离子扫描模式；多反应检测模式（MRM）。

质谱离子源参数见表2，MRM质谱参数见表3。

表2 质谱离子源参数

表3 MRM质谱参数

2 结果与分析

2.1 质谱条件的选择

对6种化合物进行正负离子模式全扫描，结果显示4-氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、赤霉素结构中含有羧基，在负离子模式下有较高响应，吲哚乙酸、吲哚丁酸结构中有氨基和羧基同时存在，6-苄基腺嘌呤有氨基存在，正负离子模式下均有响应，但正离子模式下响应远高于负离子模式，因此，6苄基腺嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丁酸采用正离子模式，4-氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、赤霉素采用负离子模式。通过全扫描方式得到6种化合物的母离子（m/z），针对母离子（m/z）的裂解电压进行优化，得到最佳的裂解电压。通过母离子碰撞扫描发现2对具有较高的丰度子离子，分别作为定性离子定量离子。在多反应监测模式（MRM）下，对定性定量离子碰撞能进行优化，得到各自最佳的碰撞能。优化离子源的雾化器压力、干燥气温度和流速等参数详见表2，最终确定离子源的雾化器压力45 psi，干燥气温度350℃，流速10 L/min。

2.2 色谱条件的选择

流动相对目标物的峰形、灵敏度及分离度也有较大的影响。试验以Agilent SB C18柱分离目标化合物，以乙腈作为有机相进行洗脱，分别考查水、0.1%甲酸水，0.05%氨水，5 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）作为水相对6种化合物分离效果的影响。结果表明，酸性条件下，对负离子电离产生抑制，在碱性条件下，对正离子电离产生抑制，以5 mmol/L醋酸铵水溶液（含0.1%甲酸）和乙腈作为流动相时，6种目标物质谱响应值理想，峰形很好。这是因为流动相的离子强度介质中更有利于离子化。因此，选用0.1%甲酸5 mmol/L醋酸铵水溶液和乙腈作为流动相。

6种生长调节剂标准MRM图（4 ng/mL）见图1。

图1 6种生长调节剂标准MRM图（4 ng/mL）

2.3 提取方式的选择

豆芽中植物生长调节剂多残留的提取溶剂主要有甲醇和乙腈，使用乙腈作为提取溶剂，能保证目标物提取效率的同时，还能沉淀蛋白降低提取液中的基质效应。6-苄基腺嘌呤、赤霉素、吲哚乙酸、吲哚丁酸不溶于水，提取液中加入2 g氯化钠，可以将水与乙腈分层，4-氯苯氧乙酸和4-氟苯氧乙酸常以4-氯苯氧乙酸钠和4-氟苯氧乙酸钠形式存在，易溶于水和碱性水溶液，加入0.1%甲酸酸化后，易溶于乙腈、乙醚等有机试剂。因此，提取溶剂选用0.1%酸化乙腈。

2.4 净化方式的选择

液液萃取法、QuEChERS法、固相萃取小柱法等是常用净化的手段，豆芽基质复杂，待测物化学性质差别较大，单靠液液萃取法无法起到净化的效果。已有文献采用QuEChERS法（分散固相萃取法）[6-9]来进行预处理，QuEChERS法简单快速。但加入的无水硫酸镁和乙酸钠粉末在去除水的同时，也会吸附少部分目标化合物，常用的吸附剂PSA(N-丙基乙二胺)、C18、GCB（石墨化炭黑）吸附机理不同，除杂效果也有差异；HLB、MCX、MAX是常用的3种净化小柱，根据试验发现HLB、MAX小柱能起到净化效果，MCX柱只对6-苄基腺嘌呤有保留，其他物质因其带有羧酸基团不适用，试验比较了QuEChERS法、HLB净化小柱和MAX复合阴离子交换小柱净化效果。

3种净化方式标物回收率比较见表4。

表4 3种净化方式标物回收率比较/%

QuEChERS法6种化合物的回收率为63.8%～98.9%，HLB小柱净化后6种化合物回收率均为90%以上，MAX净化小柱对6-苄基腺嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丁酸、赤霉素回收率均在95%以上，但对4-氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸无保留，结合实际样品测定，发现QuEChERS法处理后，样品基质效应比较强，C18与PSA粉末对赤霉素有一定的吸附，为保证回收率要控制C18与PSA粉末的加入量。MAX小柱对6-苄基腺嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丁酸、赤霉素净化效果好，对4-氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸无保留，是由于4-氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸与MAX填料吸附弱，在甲醇淋洗过程中被洗脱，HLB小柱回收率高，对6种化合物均适用，因此采用HLB小柱作为净化手段，实际检测过程中发现上样量过大后会造成回收率下降，是由于柱饱和后过载，因此选用HLB小柱作为净化手段时要控制上样量。

2.5 标准曲线、检出限

选取阴性样品，按照相同方法进行前处理，配置基质标准曲线，6种化合物的混标标准工作液质量浓度依次为 0.1，2.0，4.0，8.0，20.0，40.0 ng/mL，以化合物质量浓度为横坐标，以定量离子色谱峰峰面积为纵坐标，绘制系列标准曲线。

6种化合物线性方程、相关系数和检出限见表5。

6种化合物在测定质量浓度范围内，相关系数R2＞0.999，线性良好，以3倍信噪比计算各物质检出限如表5所示，均小于国家食品药品监督管理总局食品补充检验方法的公告（2017年第24号）附件3豆芽中植物生长调节剂的测定中规定的检出限5 μg/kg，能满足日常检验要求。

表5 6种化合物线性方程、相关系数和检出限

2.6 精密度与回收率

选取黄豆芽、绿豆芽阴性样品作为空白基质，分别添加1.0，5.0，10.0 μg/kg 3种不同水平进行加标回收试验，按试验方法进行处理，平行测定6份。

表6 精密度和回收率

精密度和回收率见表6。

黄豆芽中6种植物生长调节剂回收率在79.8%～95.6%，RSD＜5.69%，绿豆芽中6种植物生长调节剂回收率为80.9%～94.1%，RSD＜6.66%。因此，此方法适用于豆芽中6种植物生长调节剂的测定，精密度和回收率符合检测要求。

2.7 实际样品的检测

采用此方法对从市场上抽取的20批次黄豆芽、绿豆芽样品进行检测，其中6-苄基腺嘌呤有12批次检出，含量为0.5～18.5 μg/kg，均小于GB/T23381—2009食品中6-苄基腺嘌呤测定高效液相色谱法规定的检出限20 μg/kg；吲哚乙酸有4批次检出，含量为3.0～12.0 μg/kg；4-氯苯氧乙酸有9批次检出，含量为10.5～780 μg/kg；其他化合物残留量较低，均未检出。