酿酒酵母胞内物质提取工艺优化

尚 磊，王周利，高振鹏

（1.宝鸡市特种设备检验所，陕西宝鸡 721000；2.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌 712100）

酿酒酵母广泛应用于生活中，在食品生产中也得到了广泛的利用，如馒头的发酵、面包的生产、酱油的生产等，不仅在食品生产中得到了应用，在工业生产中也得到了广泛应用，包括工业生产乙醇、生产单细胞蛋白等方面[1-5]。对酿酒酵母胞内物质提取工艺进行优化，利用有机试剂提取，对胞内物质淬灭、提取条件进行优化，旨在为提高酿酒酵母胞内物质提取的利用率提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株、试验试剂

酿酒酵母，由实验室提供。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉，以上均为分析纯，北京奥博星生物技术有限责任公司提供；甲醇，色谱纯，天津科密欧化学试剂开发中心提供；高氯酸、乙醇，分析纯，天津市化学试剂一厂提供。

1.2 主要仪器与设备

灭菌锅，上海申安医疗器械厂产品；离心机，美国Labconco公司产品；水浴锅，上海司乐仪器厂产品；分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品；气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司产品。

1.3 培养基及试剂的配制

（1） 培养基的配制。菌株的培养采用YPD培养基；将配制好后于120℃条件下灭菌20 min，待用。

（2）试剂的配制。40%，60%，80%甲醇淬灭试剂；高氯酸提取试剂、沸乙醇提取试剂、纯甲醇提取试剂。

2 试验方法

2.1 菌株的活化

将冻存的甘油管的酿酒酵母用YPD培养基活化，完成第2次活化后待用[6-8]。

2.2 生长曲线的测定

将活化好的菌种以2%的比例用移液枪接种到已灭菌的培养基中，于28℃条件下发酵培养，分别培养至 0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，24 h后取样，利用分光光度计测定OD值。每次调零时均用未接种的培养基调零，以减小误差，并记录数据。

2.3 样品的淬灭

采用3种淬灭试剂淬灭，即40%，60%，80%甲醇淬灭试剂。取对数期的菌液5 mL加入预冷的淬灭试剂中，于-20℃条件下淬灭30 min，然后以转速10 000 r/min离心5 min，然后用相同的淬灭试剂清洗2次，离心得到的沉淀用提取试剂提取[9-13]。

2.4 样品提取

样品经过淬灭后，采用高氯酸提取法、冷甲醇反复冻融、沸乙醇提取3种方法提取。

（1） 用5 mL 10%（V/V） 高氯酸重悬酵母菌体，放入液氮中，然后在冰浴上解冻，反复3次。离心、吸取上清液，用10 mol/L的KOH溶液中和至pH值为7；离心、去沉淀，吸取上清液冷冻干燥。

（2） 2 mL的纯甲醇悬浮淬灭的酵母泥，在液氮中反复冻融3次，离心吸取上清液，再次用纯甲醇清洗，涡旋振荡30 s，合并2次上清液，冷冻干燥。

（3）5 mL沸乙醇溶液重悬淬灭后的酵母菌体。于90℃水浴中保温3 min，随后立即放入冰浴冷却3 min；离心后吸取上清液，冷冻干燥。

2.5 硅烷化衍生

酵母细胞经过淬灭提取、冷冻干燥得到的粉末，由于较多的代谢物含有极性官能团，并且其具有不稳定性和不挥发性，在上机测定前需要硅烷化衍生，从而有利于代谢物分子结构的确定。根据需要，以吡啶作为溶剂，乙氧基胺作为污化试剂，MSTFA作为硅烷化试剂，进行衍生反应，污化衍生90 min，硅烷化衍生30 min，衍生温度40℃。

2.6 气相色谱-质谱条件

（1）色谱柱。DB-17MS毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；采用自动进样，进样口温度300℃，载气为He（纯度99.99%），不分流进样，流量1 mL/min，进样体积1 μL。

（2） 程序升温。起始温度为100℃，保持2 min，以5℃/min的速度升温至200℃，再以10℃/min的速度升温至300℃，保持3 min。

（3）质谱条件。电子轰击电离（EI），电子能量70 eV，离子源温度250℃，接口温度280℃，质量扫描范围 50～500 m/z。

3 结果与分析

3.1 生长曲线的测定

对酵母细胞内的物质提取检测，各个时期不一样，一般选取微生物生长相对稳定的状态，选取对数后期或者稳定期可以可靠反应微生物的代谢情况。

酿酒酵母生长曲线见图1。

图1 酿酒酵母生长曲线

由图1可以看出，酿酒酵母生长速度较快，从适应期开始进入稳定期仅仅用了将近10 h的时间，在2～8 h，酿酒酵母处于对数期，此时期酵母快速生长，在10 h之后趋于稳定，为了提取酿酒酵母的胞内物质，根据图1选择12 h取样，12 h后基本趋于稳定，方便下一步研究。

3.2 代谢组淬灭的优化

对不同的方法淬灭，文献已有报道，根据试验需要，采用不同体积分数的甲醇水溶液进行淬灭，经过40%，60%，80%的甲醇水溶液淬灭后，采用冷甲醇-反复冻融提取的方法，采用GC-MS进行评价。

40%的甲醇水溶液淬灭的GC-MS离子流色谱见图2，60%的甲醇水溶液淬灭的GC-MS离子流色谱见图3，80%的甲醇水溶液淬灭的GC-MS离子流色谱见图4。

图2 40%的甲醇水溶液淬灭的GC-MS离子流色谱

图3 60%的甲醇水溶液淬灭的GC-MS离子流色谱

选用不同体积分数的甲醇水溶液（40%，60%，80%）对稳定期的酿酒酵母淬灭，在硅烷化衍生后采用气相色谱-质谱联用对其效果评估，从提取的数量上来看，60%的甲醇水溶液淬灭效果最好，提取物质最多，达到82种，分别由40%，60%，80%的甲醇水溶液作淬灭试剂，纯冷甲醇为提取试剂，采用GC-MS评价其效果，3种得到的代谢物数量分别为61，78，51 种。

图4 80%的甲醇水溶液淬灭的GC-MS离子流色谱

不同体积分数淬灭试剂提取的物质种类见表1。

表1 不同体积分数淬灭试剂提取的物质种类/个

由表1可以看出，不同的物质种类数量组成，60%的甲醇水溶液淬灭效果最好，所以选择此试剂作为最优淬灭试剂。

3.3 不同提取试剂的优化

上述试验确定了60%的甲醇水溶液作为最优淬灭试剂，此试验采用高氯酸、纯甲醇、沸乙醇作为提取试剂，以此来提取酿酒酵母胞内物质，并采用GC-MS对其进行评价，并对检测到的物质进行归类汇总。

不同提取方法代谢物见表2。

表2 不同提取方法代谢物/个

由表2可以看出，3种提取试剂中高氯酸提取效果最差，纯甲醇和沸乙醇效果较好，纯甲醇的提取物质达到83种，效果最好，甲醇具有一定的极性，沸乙醇提取的效果仅次于纯甲醇的效果，由于实际操作中，沸乙醇具有挥发性，对于提取的物质的定量计算有一定的影响，因此选择纯甲醇作为提取试剂。

4 结论

通过比较酵母胞内物质淬灭与提取的方法，不同体积分数的甲醇水溶液作为淬灭试剂，然而在60%体积分数下，淬灭效果最佳。在3种提取试剂中，沸乙醇和冷甲醇效果较好，但根据实际需要，选用效果最好的冷甲醇作为提取试剂，以利下一步的研究。

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