猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP12蛋白的表达与鉴定

张文超，虞凌雪，姜一峰，高 飞，黄勤峰，李丽薇，李慧春，陈鹏飞，杨德强，刘 欢，童光志，杜雅楠，周艳君

（1.内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特 010018；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP12蛋白的表达与鉴定

张文超1,2，虞凌雪2，姜一峰2，高 飞2，黄勤峰2，李丽薇2，李慧春2，陈鹏飞2，杨德强2，刘 欢2，童光志2，杜雅楠1，周艳君2

（1.内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特 010018；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

本研究扩增了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）HuN4株的NSP12基因，将其克隆于pCold-I载体中，获得重组质粒pCold-I-NSP12，并转化于E.coli/BL21感受态细胞，在16℃条件下用1 mmol/L的IPTG诱导20 h后，用SDS-PAGE电泳检测表达产物，结果显示在大约18 kDa处出现目标蛋白。用PRRSV特异性阳性猪血清对表达蛋白进行Western blot鉴定，结果显示该蛋白可以被PRRSV阳性猪血清识别。将重组NSP12蛋白纯化后，免疫6周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。在MARC-145细胞中，对获得的NSP12多抗血清分别进行Western blot和间接免疫荧光检测（indirect immuno fl uorescence assay，IFA）鉴定，结果显示本研究制备的NSP12多抗血清均可与感染的MARC-145细胞的PRRSV HuN4株以及在MARC-145细胞中特异表达的NSP12蛋白发生免疫反应。PRRSV NSP12蛋白的表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究NSP12在病毒感染过程中的作用奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒；NSP12；原核表达；多抗

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种急性、高度接触性传染病[1]。PRRSV在1987年于美国首次报道[2]，感染后临床症状主要为发烧、呼吸困难、耳朵发绀、厌食、肺损伤和流产等[3]。PRRS至今仍是全球养猪业的重要威胁[4]。PRRSV基因组全长约15 kb，包含ORF1a、ORF1b、ORF2～ORF7等10个开放性阅读框（open read frame，ORF）。其中ORF1a和ORF1b编码复制多聚蛋白pp1a和pp1ab，而复制多聚蛋白可进一步被自剪切成NSP1～NSP12一系列非结构蛋白（nonstructural protein，NSP）。目前已有研究证实非结构蛋白NSP1α、NSP1β、NSP2、NSP4、NSP11都有抑制I型干扰素表达的作用[5]，其中NSP2突变频率较高，对病毒的复制有重要作用[6]；NSP9是PRRSV中高度保守的RNA依赖的RNA聚合酶[7]，主要参与病毒RNA转录和复制过程；NSP10是解旋酶；NSP11是核酸内切酶[8]。有研究认为Nsp9和Nsp10是HP-PRRSV毒力相关主要基因[9]。关于NSP12功能研究相对较少。Yu等[10]研究证明NSP12可以使转录激活因子727位丝氨酸（pSTAT1-S727）磷酸化增加，且诱导IL-1β和IL-8的表达，但抑制机制尚未解析。王蓉等[11]研究认为NSP12、GP3和N蛋白对干扰素刺激应答元件（ISRE）启动子有抑制作用，这几个蛋白的共同作用可以抑制干扰素介导的抗病毒作用，从而为病毒复制获得时间。本实验室前期试验证实NSP12蛋白能够抑制IFN-β的表达，但其作用机理尚未完全明确[12]。为了进一步探讨NSP12蛋白的功能，本研究对NSP12蛋白进行了表达并制备特异性多抗，为后期研究NSP12蛋白在病毒感染中的作用提供试验材料。

1 材料与方法

1.1 病毒、载体与试验动物 PRRSV HuN4株、PRRSV阳性猪血清和真核表达载体pCAGGS-NSP12由本实验室构建并保存；冷休克表达载体pCold-Ⅰ购自TaKaRa公司；6周雌性BALB/c小鼠购自上海斯莱克公司。

1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司；反转录试剂盒、蛋白预染Marker购自Thermo公司；EX Taq购自TaKaRa公司；限制性内切酶XhoI和EcoR I购自NEB公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司；HRP标记山羊抗猪IgG抗体购自Santa Cruz公司。

1.3 NSP12基因的扩增 根据GenBank中PRRSV HuN4株核苷酸序列（登录号：EF635006）[13]，利用Primer premier 5.0软件设计1对针对NSP12基因的特异性引物（表1）。提取PRRSV HuN4株基因组RNA，反转录合成cDNA后，利用合成的NSP12-F/NSP12-R引物对进行PCR扩增，反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10 min。

表1 HP-PRRSV NSP12引物序列Table 1 Primers designed to amplify the HP-PRRSV Nsp12 gene

1.4 表达载体的构建 胶回收RT-PCR扩增获得的PCR片段，经XhoI和EcoR I双酶切后连接至经同样双酶切处理的冷休克表达载体pCold-I，连接产物转化于E.coli/BL21感受态菌株中，经挑菌、摇菌，提质粒，表达载体分别进行PCR、双酶切鉴定和质粒测序鉴定（由上海生物工程公司进行测序验证）。

1.5 蛋白的表达与鉴定 将阳性重组菌株接种于含有氨 抗性的培养基中，37℃振荡培养至OD260为0.6～1.0，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，在16℃恒温振荡诱导不同时间，分别收获诱导表达产物，进行SDS-PAGE电泳检测最佳诱导条件；将表达产物转印至NC膜上，用5%脱脂乳室温封闭3 h，利用1∶5000稀释的抗PRRSV阳性猪血清作为一抗，1∶10 000稀释HRP标记的羊抗猪IgG作为二抗，进行Western blot鉴定，通过化学发光法显色观察检测结果。

1.6 NSP12蛋白多抗的制备及鉴定 利用BCA浓度试剂盒测定纯化后的NSP12蛋白浓度，按100 μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化，按常规小鼠免疫小时程序免疫6周龄BALB/c小鼠。经3次免疫后，采集并分离免疫鼠血清。分别利用PRRSV HuN4株感染48 h后的MARC-145细胞和将真核载体pCAGGS-NSP12转染48 h后的MARC-145细胞，经80%的冷乙醇固定后，对制备的NSP12多抗进行间接免疫荧光检测（indirect immunofluorescence assay，IFA）。同时分别提取HuN4株感染的MARC-145细胞总蛋白，以及真核载体pCAGGS-NSP12转染的MARC-145细胞总蛋白，对制备的NSP12多抗进行Western blot鉴定。

2 结果

2.1 pCold-NSP12表达载体的鉴定 以PRRSV HuN4株的cDNA为模板，利用特异性引物NSP12-F/NSP12-R扩增NSP12基因，结果显示，可以扩增出大小约为480 bp左右的目的片段。将其克隆至pCold I载体中，经XhoI/EcoR I双酶切酶切鉴定，结果显示，重组质粒可以被酶切成大小约为480 bp和4400 bp左右的两个片段，且测序结果与预期目标基因序列完全一致，将获得阳性表达质粒命名为pCold-NSP12。

2.2 NSP12蛋白的表达与鉴定 将阳性菌株诱导表达产物进行SDS-PAGE电泳，结果显示，在大约18 kDa的位置出现特异性蛋白条带，大小与预期相符，且该蛋白诱导36 h后表达量较高（图1）。将表达产物转印至NC膜上，利用抗PRRSV阳性猪血清作为一抗，进行Western blot鉴定，结果显示，抗PRRSV阳性猪血清能够特异性识别表达NSP12蛋白（图2）。

图1 NSP12重组蛋白的表达及纯化Fig.1 Prokaryotic expression and puri fi cation of the recombinant NSP12 protein

图2 pCold-NSP12免疫原性的检测Fig.2 Detection of recombinant NSP12 protein by Western blot

2.3 NSP12多抗的IFA鉴定 以表达纯化后的NSP12蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠，经3次免疫后制备抗NSP12蛋白的多抗。利用抗NSP12蛋白的多抗对PRRSV HuN4株感染48 h后的MARC-145细胞进行IFA检测，结果显示该多抗可以特异性识别HuN4株感染的MARC-145细胞。为了进一步确定该多抗白多抗分别对PRRSV HuN4株感染的MARC-145细胞和真核表达质粒pCAGGS-NSP12转染的MARC-145细胞进行Western blot鉴定，结果显示，在大约18 kDa左右均可检测到特异性蛋白条带，表明该多抗可以特异性识别PRRSV所表达的NSP12蛋白（图4）。的特异性，利用抗NSP12蛋白的多抗对真核表达质粒pCAGGS-NSP12转染48 h后的MARC-145细胞进行IFA检测，结果显示，该多抗可以特异性识别pCAGGS-NSP12转染的MARC-145细胞（图3）。

图3 抗NSP12蛋白多抗的IFA鉴定Fig.3 Detection the expression of NSP12 with the pAbs using IFA

2.4 NSP12多抗的Western blot鉴定 利用抗NSP12蛋

3 讨论

PRRSV是有囊膜的、单股正链RNA病毒[14]，PRRSV感染具有免疫抑制和持续感染的特性[15]，其原因可能是病毒感染会对干扰素信号通路产生抑制，进而抑制宿主天然免疫，延迟中和抗体的产生，从而使病毒难以清除，造成持续感染。NSP12蛋白作为PRRSV的一个非结构蛋白，其功能尚不完全清楚。有研究人员运用高通量测序的方法筛选并鉴定出PRRSV在其感染的靶细胞—猪肺泡巨噬细胞中与NSP12相互作用的蛋白HSP70，经分析认为NSP12可能与病毒复制有关[16]。同时在对与PRRSV病毒同属的马动脉炎病毒（Equine Arteritis virus，EVA）的研究中显示，NSP12对病毒的复制具有重要作用[17]。为了进一步探索PRRS病毒NSP12蛋白在病毒感染中的作用，本研究利用pCold-I载体成功地表达了NSP12蛋白。Western blot显示，表达的蛋白可被PRRSV猪阳性血清识别，表明其具有较好的免疫原性。在低温诱导的条件下，NSP12蛋白可以获得高效表达，其中少量呈可溶性表达，大部分是以包涵体的形式存在。将表达的蛋白经尿素溶解变性和透析复性后，可获得高纯度的NSP12蛋白。为了进一步确定该蛋白的活性，将纯化后的蛋白免疫小鼠，制备了针对PRRSV NSP12的多抗。经Western blot和IFA检测证实该多抗可以识别病毒在感染MARC-145细胞中表达的NSP12蛋白，也能识别单基因真核表达的NSP12蛋白。本研究表达的NSP12蛋白抗原性较好，获得的多抗特异性强，可以作为今后开展对NSP12蛋白功能研究的辅助工具。

图4 NSP12蛋白多抗的Western blot鉴定Fig.4 Western blot analysis of the anti-NSP12 polyclonal antibody

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PROKARYOTIC EXPRESSION AND IDENTIFICATION OF NONSTRUCTURAL PROTEIN 12 OF PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS

ZHANG Wen-chao1,2, YU Ling-xue2, JIANG Yi-feng2, GAO Fei2, HUANG Qin-feng2, LI Li-wei2,LI Hui-chun2, CHEN Peng-fei2, YANG De-qiang2, LIU Huan2, TONG Guang-zhi2, DU Ya-nan1,ZHOU Yan-jun2

(1. College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The non-structural protein12 (NSP12) of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) was ampli fi ed and cloned into the pCold-I vector. The recombinant plasmid pCold-Nsp12 was then transformed into E.coli/BL21 cells and induced with 1 mmol/L isopropyl β -D-thiogalactoside (IPTG) at 16℃ for 20 h. The recombinant protein was purified and identified with SDS-PAGE as about 18kDa band and also recognized in Western blotting using PRRSV antisera. Subsequently, the purified recombinant Nsp12 protein was administered into 6-week-old BALB/c mice for production of polyclonal antibodies. The antisera collected from these immunized mice speci fi cally reacted with PRRSV HuN4 strain and NSP12 protein expressed in MARC-145 in IFA and Western blotting.The present study laid a basis for further study on the role of NSP12 in PRRSV infection.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, NSP12, prokaryotic expression, polyclonal antibody

S852.659.6

A

1674-6422（2018）01-0032-05

2017-03-22

973 计划项目（2014CB542702）；国家科技支撑计划课题（2015BAD12B01-1）；国家生猪现代产业技术体系项目（CARS-36）

张文超，女，硕士研究生，预防兽医学专业

周艳君，E-mail：yjzhou@shvri.ac.cn；杜雅楠，E-mail：yanandu@126.com