Lyn激酶对肺腺癌EGFR下游信号通路的调节作用研究

戴 曦，李国平，杨小琼，王孝芸，伍 娟，梁丽娴

1.西南医科大学附属医院呼吸内一科，四川 泸州 646000；

2.澳门科技大学中药质量研究国家重点实验室/澳门药物与健康应用研究院，澳门特别行政区 999078；

3.成都市第三人民医院/西南交通大学附属医院呼吸内科，四川 成都 610000；

4.西南医科大学附属医院炎症与变态反应实验室，四川 泸州 646000；

5.四川省第二中医医院呼吸内科，四川 成都 610000

我国由于工业化速度加快、环境污染加重等因素，现已位居肿瘤发病率和死亡率榜首，成为因肺癌死亡人数攀升最快的国家。国家癌症中心发布数据显示，2006—2011年，我国肺癌发病率为130.2万，其中，男性84.6万，女性45.6万［1］。到2015年，我国全年约有429万例新发癌症患者和281万例因癌症导致的死亡患者，其中，无论是发病率还是死亡率，肺癌均占据第1位［2］。据美国发布的数据显示，2016年美国大约有224 390例新发肺癌患者，共15 808例患者死于肺癌［3］。由此可见，肺癌在全球范围内都是发病率、死亡率极高的肿瘤，造成的社会负担日趋沉重，是一个亟待解决的公共健康问题。目前我国肺癌采用的是手术、化疗、放疗及生物治疗相结合的综合治疗方法，但其1和5年生存率仅为44%和17%，其中小细胞肺癌的5年生存率仅7%［4］。肺癌的发生、发展是一个多基因参与、多因素影响和多步骤进展的复杂过程，近年来，虽然针对非小细胞肺癌的分子靶向药物取得了一定的疗效，但仍有较多限制，因此深入研究肺癌，正确认识其生物学特性，进一步寻找新的调节靶点，并由此发现新的药物针对潜在分子治疗靶点进行治疗，对于肺癌的防治至关重要。

Lyn激酶是受体酪氨酸蛋白激酶(Src family of protein tyrosine kinases，SFK)家族的重要成员之一，该家族作为细胞信号转导的关键酶，广泛参与机体免疫应答、炎性反应等病理生理过程［5］。在进一步的研究中，越来越多的证据表明，SFK家族成员参与多种实体肿瘤的发生、发展。本研究着重探讨Lyn激酶通过影响表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)下游信号通路调节EGFR突变肺腺癌细胞株Hcc827发生、发展的分子机制，对于肺腺癌的诊断、分子靶向治疗都有重要的意义。

1 材料和方法

1.1 实验试剂

人肺腺癌细胞株Hcc827(EGFR外显子19缺失突变，购自美国模式培养物保藏所)由澳门科技大学中药质量研究国家重点实验室冻存并复苏；5周龄雄性裸鼠购自重庆腾鑫比尔实验动物公司；EFIA-eGFP-puro、EFIA-eGFP-Lyn-puro慢病毒载体构建于赛业(广州)生物科技有限公司；Lyn、EGFR、p-EGFR、STAT3、p-STAT3和Bcl-2抗体购自英国Abcam公司；PI3K、p-PI3K、AKT1、p-AKT1、小鼠抗兔二抗和猴抗小鼠二抗购自美国Santa公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Hcc827细胞株培养及慢病毒转染

将合适密度的Hcc827细胞置于37 ℃、CO2体积分数为5%的恒温箱中培养，培养基为预热的RPMI-1640完全培养基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素双抗)，隔天更换培养基，所有操作均在超净工作台上完成。选择对数生长期细胞，当细胞汇合度约为85%时，常规胰酶消化计数，将细胞按2×105/ 孔接种于6孔板，待细胞汇合度达到30%时，弃原培养基，每孔加入1 mL新鲜无血清培养基，分别加入适量EFIA-eGFP-puro(Hcc827-GFP，空载体对照组)或EFIA-eGFP-Lyn-puro(Hcc827-Lyn+/+，Lyn高表达实验组)病毒液，培养24 h后观察细胞状态并更换新鲜全培养基，培养48 h后在荧光显微镜下观察到明显绿色荧光表达证实转染成功。

1.2.2 裸鼠荷瘤实验

5周龄Balb/c-nu裸鼠15只，随机分为3组(n=5)，选择对数生长期Hcc827细胞和稳定转染的Hcc827-GFP、Hcc827-Lyn+/+细胞，常规胰酶消化，用无血清的RPMI-1640培养基调整细胞浓度为1×106/mL，用1 mL注射器将细胞与基质胶1∶1混合液注射至裸鼠前腿根部皮下，每只裸鼠注射0.2 mL，第2天使用游标卡尺测量肿瘤大小，长轴记为A，短轴记为B，肿瘤体积=A×B2/2，绘制肿瘤生长曲线。第35天脊髓离断处死裸鼠，剥离瘤块。裸鼠的饲养及相关操作均于西南医科大学SPF级实验动物房中完成。

1.2.3 免疫荧光检测肿瘤细胞Lyn蛋白表达

选择对数生长期Hcc827、Hcc827-GFP和Hcc827-Lyn+/+细胞，以较低密度接种于共聚焦皿，第2天换液，待观察到形成细胞克隆群时以4%多聚甲醛固定细胞30 min，依次完成细胞核穿孔、封闭、温育一抗、二抗及DAPI染色等步骤，在共聚焦显微镜下观察Lyn蛋白表达水平。

1.2.4 MTT实验

选择对数生长期Hcc827、Hcc827-GFP和Hcc827-Lyn+/+细胞，按5×103个/孔接种于96孔板上，每孔100 µL，每组设10个复孔，37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下分别培养24和48 h；另将上述3种细胞按3×103个/孔接种于96孔板上，每孔100 µL，每组设10个复孔，37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下培养72 h。避光条件下每孔加入MTT溶液10 µL，在培养箱中继续培养3 h取出，300×g离心5 min，弃上清液，每孔加入100 µL Formanzan溶解液，继续培养4 h，在显微镜下观察到黑紫色结晶完全溶解后，摇床振荡摇匀，酶标仪检测570 nm波长处吸光度(D)值，并计算存活率，存活率(%)=(实验组D值－空白组D值)/(对照组D值－空白组D值)×100%。

1.2.5 克隆实验

选择对数生长期Hcc827、Hcc827-GFP和Hcc827-Lyn+/+细胞，调整细胞浓度后按500个/皿接种于直径60 mm的培养皿中，第2天更换培养基。10 d后弃培养基，4%多聚甲醛固定30 min，瑞氏-吉姆萨染液染色，观察克隆形成情况。

1.2.6 侵袭实验

低温下用无血清的RPMI-1640分别将Matrigel稀释至3 mg/mL，人纤维连接蛋白稀释至125 µg/mL，分别均匀涂在Transwell上室的内、外表面，超净工作台内过夜干燥，使用前用紫外线照射1 h。水化1 h后在下室中加入1 mL RPMI-1640全培养基，将对数生长期的Hcc827、Hcc827-GFP和Hcc827-Lyn+/+细胞按1×105个/mL的密度重悬于含0.1%胎牛血清蛋白的RPMI-1640无血清培养基中，每孔300 µL细胞悬液，每组设置3个复孔，37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下培养24 h，4%多聚甲醛固定上室外表面30 min，瑞氏-吉姆萨染液染色，在显微镜下观察穿膜细胞数。

1.2.7 蛋白［质］印迹法(Western blot)检测EGFR、p-EGFR、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、STAT3、p-STAT3、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平

将对数生长期Hcc827细胞和稳定转染的Hcc827-GFP、Hcc827-Lyn+/+细胞接种于6孔板上，37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下培养48 h，提取总蛋白并测定蛋白浓度；配制SDSPAGE凝胶，按步骤完成电泳，转膜，封闭，一抗、二抗温育，洗膜，显影，测量灰度值。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件对实验结果进行统计学分析。除裸鼠荷瘤实验外，所有实验均重复3次，计量数据用x±s表示，完成数据正态性检验和方差齐性检验，多组比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD或Tamhane’s法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 裸鼠荷瘤实验结果

裸鼠荷瘤实验结果显示，以相同细胞数目接种在相同条件下饲养35 d，Hcc827-Lyn+/+细胞表现出更强的成瘤能力，接种Hcc827-Lyn+/+细胞的裸鼠最终成瘤体积平均值为591.0 mm3，明显大于Hcc827细胞(253.2 mm3)和Hcc827-GFP细胞(240.9 mm3)接种裸鼠，差异有统计学意义(F=8.583，P=0.005，图1A)。瘤块生长曲线显示，Hcc827-Lyn+/+细胞组成瘤能力明显高于Hcc827细胞和Hcc827-GFP细胞组，后两者生长曲线趋于一致(图1B)；组间比较结果显示，在不同时间点，Hcc827细胞组和Hcc827-GFP细胞组接种裸鼠之间，瘤体大小差异无统计学意义(P＞0.05)，而Hcc827-Lyn+/+细胞接种裸鼠的瘤体大小大于Hcc827细胞组，差异有统计学意义(P＜0.05，图1C)。

图 1 Lyn 激酶高表达促进体内种植的Hcc827细胞生长Fig. 1 Over-expression of Lyn kinase promotes growth of Hcc827 cell line in vivo experiment

2.2 免疫荧光检测肿瘤细胞Lyn蛋白表达

在共聚焦显微镜下观察，Hcc827-Lyn+/+细胞组荧光强度高于Hcc827和Hcc827-GFP细胞组，即Hcc827-Lyn+/+细胞组Lyn蛋白表达高于Hcc827细胞组和Hcc827-GFP细胞组，提示转染成功(图2A)。

2.3 MTT实验检测Lyn激酶高表达对Hcc827细胞生长的影响

结果显示，培养24、48和72 h时，Hcc827-Lyn+/+细胞组D值均高于Hcc827细胞组和Hcc827-GFP细胞组，以Hcc827细胞组为参照，Lyn激酶高表达提高了Hcc827细胞的存活力。而空载体对照组Hcc827-GFP细胞组与Hcc827细胞组比较，差异无统计学意义(P＞0.05，表1，图2B、C)。

2.4 克隆实验检测Lyn激酶高表达对Hcc827细胞增殖能力的影响

结果显示，Hcc827细胞组克隆形成数为94.67个/皿，Hcc827-GFP细胞组克隆形成数为96.00个/皿，Hcc827-Lyn+/+细胞组克隆形成数为166.33个/皿。Hcc827-GFP细胞组与Hcc827细胞组比较，差异无统计学意义(P=0.909)，而Hcc827-Lyn+/+细胞组克隆形成数明显高于Hcc827细胞组和Hcc827-GFP细胞组，组间比较，差异有统计学意义(P均=0.001)。Lyn激酶明显促进了Hcc827细胞的增殖(图3)。

2.5 侵袭实验检测Lyn激酶高表达对Hcc827细胞侵袭能力的影响

在10倍目镜下观察，结果显示，Hcc827细胞组穿膜细胞数为27.27个/视野；Hcc827-GFP细胞组穿膜细胞数为26.47个/视野；Hcc827-Lyn+/+细胞组穿膜细胞数为54.87个/视野。Hcc827-GFP细胞组与Hcc827细胞组比较，差异无统计学意义(P=0.776)，而Hcc827-Lyn+/+细胞组穿膜细胞数明显高于Hcc827细胞组和Hcc827-GFP细胞组，组间比较，差异有统计学意义(P均＜0.001)。Lyn激酶高表达增强了Hcc827细胞的侵袭能力(图3)。

图 2 Lyn激酶高表达促进体外培养的Hcc827细胞增殖Fig. 2 Over-expression of Lyn kinase promotes proliferation of Hcc827 cell line in vitro experiment

表 1 MTT实验比较各组D值及存活率Tab. 1 Comparison of D value and survival rate among each group by MTT experiment

图 3 Lyn激酶高表达增强体外培养的Hcc827细胞的克隆和侵袭能力Fig. 3 Over-expression of Lyn kinase enhances the ability of cloning and invasion of Hcc827 cell line

2.6 Western blot检测EGFR及其下游信号通路相关蛋白表达水平

Western blot结果显示，与Hcc827细胞组和Hcc827-GFP细胞组比较，Hcc827-Lyn+/+细胞组Bcl-2蛋白表达升高，Caspase-3蛋白表达降低，提示Lyn激酶高表达改变了Hcc827细胞凋亡相关蛋白平衡，上调了抑凋亡蛋白表达水平同时下调了促凋亡蛋白表达水平。并且，Hcc827-Lyn+/+细胞组EGFR、p-EGFR，以及其下游信号通路相关蛋白PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、STAT3和p-STAT3的表达均明显升高，提示Lyn激酶高表达进一步激活了EGFR信号通路，通过该信号通路发挥其促进Hcc827细胞增殖、侵袭的作用(图4、5)。

图 4 Western blot检测相关蛋白表达水平Fig. 4 Expression level of the related proteins detected by Western blot

图 5 Lyn激酶通调节EGFR信号通路影响Hcc827细胞生物学特性Fig. 5 Lyn kinase affects the biological characteristics of Hcc827 cell line through EGFR signal pathway

3 讨 论

SFK属于非受体类蛋白酪氨酸激酶家族，该家族成员之间的蛋白质结构具有高度的同源性，包括SH1(酶促反应结构域)、SH2和SH3(调节SFK活性的关键结构域)、特异性N端SH4结构域及C端酪氨酸激酶功能域，当SH1区域的416位点正控区发生磷酸化时SFK被激活，进而通过其形成的一系列不同细胞膜受体在细胞生长、分化、迁移、形态特征及生存等信号转导中发挥着关键作用［6-7］。近年来，越来越多的证据显示，SFK通过生长因子信号级联参与实体肿瘤的发生、发展［8-12］，其中Lyn激酶是SFK家族重要成员，在整合素信号途径中扮演关键角色，该信号通路与肿瘤浸润转移关系密切，同时已经明确EGFR是肺腺癌生长、侵袭的关键表面受体之一，EGFR通过持续激活，形成二聚化后刺激Ras蛋白，导致磷酸化级联反应的发生来激活其下游PI3K/Akt信号通路，从而引起肿瘤的发生、发展。因此，我们预测Lyn激酶与EGFR信号通路存在关联，进而对肺腺癌发挥调节作用。

多变量分析中提到，Lyn表达水平与总体低存活率有关，尤其在不吸烟的女性肺腺癌患者中表现突出，使用SFK抑制剂达沙替尼抑制Lyn活性后能降低Lyn高表达的肺腺癌细胞株的存活率和远处转移能力［13］。另有学者提出，EGFR磷酸化调节与Lyn激酶活性有关，该效应是通过RACK1和Cbp/PAG蛋白实现的［14］。此外，国内外尚缺乏更多相关研究报道。在前期研究中，我们发现人肺腺癌组织中Lyn表达明显高于癌周正常组织，但我们在鳞癌、小细胞癌组织中，并没有发现Lyn高表达，进一步支持Lyn激酶与EGFR可能存在的相关性。本研究选用19号密码子缺失的EGFR突变细胞株Hcc827，通过建立Lyn激酶高表达细胞株，发现Lyn对该细胞株的增殖、克隆及侵袭能力均起到了促进作用，裸鼠荷瘤实验中，Hcc827-Lyn+/+细胞株也表现出更强的成瘤能力和倍增能力。进一步的机制研究证实，Lyn明显上调了EGFR表达和磷酸化水平，并且激活了下游PI3K/PDK/AKT和JAK/STAT3信号通路，将EGFR信号转导入细胞中。

在肿瘤中，PI3K/PDK/AKT信号通路的编码基因存在DNA水平的结构突变，缺乏iSH2和C-SH2结构域，这种突变直接导致PI3KT/AKT信号通路的活化和细胞转化，尤其AKT，是针对肿瘤细胞凋亡、增殖、侵袭及转移进行调节的关键信号因子［15］。Lyn激酶不仅通过持续激活EGFR影响肺腺癌细胞生物学特性，也与EGFR下游信号通路形成Lyn/PI3K/Akt、Lyn/STAT3信号途径，直接磷酸化STAT3［16］，参与EGFR突变肺腺癌细胞株的增殖、凋亡、侵袭及转移。Lyn激酶对肺癌的调节还有待更深入的研究，进一步阐释其机制，这有助于将肺癌生物靶向治疗和个体化精准治疗推向一个新的高度。

［1］ 石远凯, 孙 燕, 于金明, 等. 中国晚期原发性肺癌诊治专家共识(2016年版) ［J］. 中国肺癌杂志, 2016, 19(1): 1-15.

［2］ CHEN W, ZHENG R, BAADE P D, et al. Cancer statistics in China, 2015 ［J］. CA Cancer J Clin, 2016, 66(2): 115-32.

［3］ SMITH R A, MANASSARAM-BAPTISTE D, BROOKS D, et al. Cancer screening in the United States, 2015: a review of current American cancer society guidelines and current issues in cancer screening ［J］. CA Cancer J Clin, 2015, 65(1):30-54.

［4］ BRAY F I, WEIDERPASS E. Lung cancer mortality trends in 36 European countries: secular trends and birth cohort patterns by sex and region 1970—2007 ［J］. Int J Cancer,2010, 126(6): 1454-66.

［5］ BUNDELA S, SHARMA A, BISEN P S. Potential therapeutic targets for oral cancer: ADM, TP53, EGFR, LYN, CTLA4,SKIL, CTGF, CD70 ［J］. PloS one, 2014, 9(7): e102610.

［6］ PARSONS S J, PARSONS J T. Src family kinases, key regulators of signal transduction ［J］. Oncogene, 2004,23(48): 7906-7909.

［7］ MELLO A A, LEAL M F, REY J A, et al. Deregulated expression of SRC, LYN and CKB kinases by DNA methylation and its potential role in gastric cancer invasiveness and metastasis［J］. PloS one, 2015, 10(10): e0140492.

［8］ BJORGE J D, JAKYMIW A, FUJITA D J. Selected glimpses into the activation and function of Src kinase［J］. Oncogene,2000, 19(49): 5620-5635.

［9］ 林 伟, 陈金坤, 邱仙土, 等. Src酪氨酸激酶在人胃癌细胞转移中的作用和机制［J］. 中国癌症杂志, 2012, 22(3):177-182.

［10］ 孔 璐, 张玉祥, 孙 林, 等. 人胰腺癌细胞株HPAC和BxPC-3中Src/MAPK信号转导途径中pp60c-Src和pERK1/2表达的差异［J］. 首都医科大学学报, 2008, 29(5): 589-592.

［11］ 孙释然, 玉素甫·买买提, 阎 语, 等. 非受体酪氨酸激酶在乳腺癌组织的表达及其与预后的关系［J］. 中华实验外科杂志, 2016, 33(1): 208-210.

［12］ 颜 歌, 杜 祥. 结直肠癌侵袭转移机制研究进展 ［J］.中国癌症杂志, 2005, 15(6): 579-582.

［13］ KIM Y J, HONG S, SUNG M, et al. LYN expression predicts the response to dasatinib in a subpopulation of lung adenocarcinoma patients ［J］. Oncotarget, 2016, 7(50):82876-82888.

［14］ SUTTON P, BORGIA JA, BONOMI P, et al. Lyn, a Src family kinase, regulates activation of epidermal growth factor receptors in lung adenocarcinoma cells ［J］. Molecular Cancer, 2013, 12(1): 76.

［15］ 孙晓杰, 黄常志. PI3K-Akt信号通路与肿瘤 ［J］. 世界华人消化杂志, 2006, 14(3): 306-311.

［16］ WANG L, KUROSAKI T, COREY S J. Engagement of the B-cell antigen receptor activates STAT through Lyn in a Jakindependent pathway ［J］. Oncogene, 2007, 26(3): 2851-2859.