miR-16对人肝癌细胞BEL-7402增殖与凋亡的影响

缪 欣，丁 岚，刘 浩，李晓敏，徐 聪，贾筱琴，李国利

1.扬州大学医学院病理学教研室，江苏 扬州 225009；

2.扬州市江都人民医院病理科，江苏 扬州225000

微小RNA(microRNA，miRNA)长度一般为18～25个核苷酸，广泛存在于真核生物中，属于高度保守与非编码的小分子单链RNA的一种。miRNA具有癌基因和抑癌基因的作用，直接或间接参与肝癌的发生、发展。成熟的miR-16来源于两个不同的前体miR-16-1和miR-16-2。miR-16-1位于人类基因组脆弱点11q24，同时也是秀丽线虫lin-4的同源基因，在人类卵巢癌、子宫癌、乳腺癌和肺癌患者体内均可发现此位点基因的缺失突变。课题组前期研究应用miRNA芯片技术筛选出肝癌组织差异表达miRNA，发现miR-16在肝癌组织中表达下调。推测出现miR-16表达的下调可能与肿瘤细胞的快速增殖有关。本实验初步探讨miR-16对BEL-7402肝癌细胞的增殖及凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

人BEL-7402肝癌细胞及293T细胞购自上海酶研生物科技有限公司；RPMI-1640及DMEM购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，凋亡试剂盒购自美国eBioscience公司；倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

配制含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的RPMI-1640完全培养基，接种人BEL-7402肝癌细胞株，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的饱和湿度培养箱中培养，细胞贴壁生长，0.25%胰酶消化传代。

1.2.2 过表达miR-16慢病毒稳定细胞株的建立

将慢病毒载体质粒(LV-hsa-miR-16-1)和包装质粒混合物(Lenti-Easy Packaging Mix)混合，在混合后的物质中加入脂质体(LipofectamineTM2000)，形成脂质体复合物(DNA-LipofectamineTM2000复合物)，加入293T细胞(要求293T细胞的细胞密度在80%左右，并处于对数生长期、已进行共转染)，将集中的细胞混匀，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中进行细胞培养。转染8 h后，将培养液更换为DMEM细胞培养基(含胎牛血清10%)，培养48～72 h后，收集慢病毒颗粒的细胞上清液，将搜集到的上清液进行浓缩与纯化处理，可得到滴度与纯度均较高的慢病毒浓缩液，转染293T细胞后进行病毒滴度测定。

1.2.3 慢病毒感染人BEL-7402肝癌细胞

感染前24 h，取对数生长期的BEL-7402肝癌细胞，胰酶消化制成细胞悬液，计数调整细胞的浓度，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养，待细胞融合度达到30%左右时停止。根据BEL-7402肝癌细胞的MOI值，加入适量的浓缩病毒液，感染16 h后，更换培养基；感染96 h后，采用倒置荧光显微镜观察绿色荧光的强度，检测慢病毒颗粒的感染效率。

1.2.4 采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)检测细胞增殖

选择对数生长期的细胞，胰酶消化后培养基重悬制成细胞悬液。使用血球计数板计数细胞，以每孔2 000个细胞的标准，于96孔板中进行细胞接种。实验分为miR-16感染组和阴性对照组，每组5个复孔，每孔100 μL，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。分别培养0、1、2、3、4和5 d后，每孔加入10 μL CCK-8，2～4 h后，振荡器振荡5～10 min，酶标仪450 nm进行吸光度(D)值检测，以各时间点的D值为依据，绘制出详细的细胞生长曲线图。

1.2.5 流式细胞术检测细胞周期

确保细胞还未进入生长平台期时，选择生长覆盖率在80%左右的细胞进行试验，收集转染48 h的人BEL-7402肝癌细胞，PBS洗涤，细胞浓度调整为1×106/mL，使用70%的乙醇进行固定，加入36 μL的PI(2 mg/mL)、14.5 μL的RNase(10 mg/mL)及1 450 μL的PBS重悬，室温避光温育10 min，流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡

收集人BEL-7402肝癌细胞，将细胞浓度调整为1×106/mL，加入10 μL的annexin V-PE进行细胞染色，室温避光10～15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3 统计学处理

应用SPSS 17.0软件对本次研究中的数据进行处理和统计，实验数据为计量资料，用x±s表示，采用t检验对组间差别进行检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 过表达miR-16慢病毒稳定细胞株

目的质粒转染293T细胞荧光显微镜观察结果见图1。过表达miR-16慢病毒BEL-7402肝癌细胞稳定株荧光显微镜下观察结果见图2。

2.2 感染miR-16慢病毒对BEL-7402肝癌细胞增殖能力的影响

miR-16慢病毒对BEL-7402肝癌细胞感染后，采用CCK-8检测细胞的生长情况，根据细胞的生长状况，绘制细胞增殖曲线图(图3)。结果显示，感染组在2 d前差异无统计学意义(P＞0.05)，而在2～5 d差异有统计学意义(P＜0.05)。表明感染miR-16慢病毒后，BEL-7402肝癌细胞的增殖能力明显降低。

图 1 目的质粒转染293T细胞Fig. 1 The target plasmid was transfected into 293T cells

图 2 过表达miR-16慢病毒稳定细胞株Fig. 2 Over-expression of miR-16 lentivirus stable cell lines

2.3 感染miR-16慢病毒对BEL-7402肝癌细胞周期的影响

BEL-7402肝癌细胞感染miR-16慢病毒，流式细胞术检测细胞周期(图4)。与阴性对照组相比，BEL-7402细胞周期的G1期细胞百分率下降，S及G2/M细胞的百分率数值上升，差异有统计学意义(P＜0.05)，证明miR-16可使BEL-7402肝癌细胞部分停滞于S及G2/M期，延缓了细胞分裂的速度，抑制了细胞增殖。

2.4 感染miR-16慢病毒对Bel-7402肝癌细胞凋亡的影响

人BEL-7402肝癌细胞感染miR-16慢病毒后，采用流式细胞仪对两组细胞凋亡率进行检测，差异有统计学意义(P＜0.05，图5、6)，证明miR-16对7402肝癌细胞的凋亡有较为明显的作用和影响。

图 3 过表达miR-16慢病毒对BEL-7402肝癌细胞增殖能力的影响Fig. 3 Effects of over-expression of miR-16 lentivirus on the proliferation of BEL-7402 hepatocarcinoma cells

图 4 过表达miR-16对Bel-7402肝癌细胞周期影响Fig. 4 Overexpression of miR-16 on cell cycle of BEL-7402 hepatocarcinoma cells

图 5 流式细胞术检测两组细胞凋亡情况Fig.5 Detect the apoptosis of the two groups by fl ow cytometry

图 6 过表达miR-16对BEL-7402肝癌细胞凋亡的影响Fig. 6 Effects of over-expression of miR-16 on apoptosis of BEL-7402 hepatocarcinoma cells

3 讨 论

肝癌对于人类的生存健康有着极大的威胁，属于病死率较高的恶性肿瘤。据统计，近年来我国死于肝癌的患者逐渐增多，年平均值已达到30万左右，占全球肝癌死亡人数的50%左右，肝癌的高死亡率为我国医学界造成了极大的难题和负担［1-4］。肝癌治疗研究虽然已深入至基因水平，但目前仍没有找出对治疗有效且具有特异性的分子靶点。

miRNA目前多数存在于真核生物中，属于高度保守及非编码的小分子单链RNA的一种。miR-16/miR-15a主要靶向抑制Bcl-2、WT-1、WNT3A、MCA1、MCL1及CCDN1等致癌基因的活性，进而促进肿瘤细胞的凋亡［5］。miR-16最早被发现在白血病中表达下调［7］，miR-16在肝癌、胃癌、垂体腺瘤、肺癌、前列腺癌和多发性骨髓瘤中表达均下调［8］。近年来研究发现，miR-16/miR-15a亦可靶向抑制血管内皮生长因子的分泌而发挥抗肿瘤活性［6］。

本研究表明，相对于阴性对照组，BEL-7402细胞周期中G1期细胞百分率下降，S及G2/M期细胞的百分率上升，表明miR-16可使BEL-7402肝癌细胞部分停滞于S及G2/M期，从而延缓细胞分裂的速度。因此，进一步证实了miR-16抑制癌细胞的机制之一是通过影响细胞周期从而抑制细胞的增殖。

有研究报道，miR-16负调控Bcl-2，miR-16的缺失或下调，导致Bcl-2表达的升高，促进白血病、淋巴瘤和前列腺癌的发生。进一步研究发现，miR-16通过激活外源性APAF-1-胱天蛋白酶-9-PARP凋亡途径，参与凋亡过程［11］。本研究初步证实，miR-16能抑制肝癌Bel-7402细胞增殖及促进细胞凋亡，而miR-16介导肝癌细胞增殖和调节细胞凋亡的分子机制，仍需后续实验进一步探讨。

综上，本研究发现，miR-16过表达能抑制肝癌BEL-7402细胞增殖及促进细胞凋亡，提示miR-16有望成为肝癌基因治疗重要的新靶点。相信随着研究的深入，miR-16在癌症治疗方面的应用价值将逐渐展现出来。

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