三七皂苷预防异丙肾上腺素所诱导小鼠阵发性房颤发生的机制研究

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房颤(atrail fibrillation，AF)即室上性快速性心律失常，由心房发出的不规律心房激动。由于其无效性的心房收缩代替了有节律的心房收缩，机体可表现为疲劳、心悸、晕厥乃至心力衰竭等，严重影响着人类生活质量及生命健康。随着年龄的增加，AF发生率逐渐增加，美国心脏学会(America Heart Association，AHA)指出，60岁以下的成人AF发生率小于1%，而75岁到84岁老年人中，AF的发生率高达12%。且在欧洲人群中，40岁以上男性和女性发生AF的危险性分别为26%和23%。我国流行病学指出，40岁以下成人中AF发生率为0.1%，而80岁以上男性和女性每年AF年的发生率分别为2%和1.5%[1- 4]。目前，AF的药物治疗中主要为抗凝药物的选用，而针对于AF本身的药物研究依旧是该研究领域中的一大空缺，因此新药的开发尤其是中医药的研究应用成为预防AF发生新的切入点。本课题组前期研究结果提示，PNS可有效预防大剂量异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)所诱导的阵发性房颤的发生，并显著降低期前收缩发生率[5]。本研究探索PNS预防大剂量ISO所诱导的阵发性房颤发生的作用机制。

微小核苷酸(microRNAs，miRNAs)是由19～25个碱基所构成的非编码RNA，在基因转录后表达中起着关键的调控作用。据预测，miRNAs通过与靶基因3’UTRs结合控制着30%～50%基因的蛋白质编码，参与心脏发育、心肌重塑、心肌细胞凋亡等病理生理过程，在诸多心血管疾病的发生发展过程中引着重要的作用[6- 7]。因此，本研究围绕miRNAs差异表达进一步探索PNS抗ISO所诱导阵发性房颤发生的作用机制，以期为PNS的临床应用提供有力的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 C57BL/6，雄性小鼠，体重20.58 g±0.65 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.2 试剂与仪器 三七皂苷购自泛亚生命科技有限公司；异丙肾上腺素购自上海源叶生物科技有限公司。Annexin V荧光染料购自BD公司(美国)；总RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司(德国)；逆转录试剂盒购自QIAGEN公司(德国)。植入式无线遥测系统购自美国Date Sciences International (DSI) 公司；实时荧光定量PCR分析仪购自Roche Diagnostics公司(瑞士)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组 将54只C57BL/6雄性小鼠，随机分为正常组(n=18)、模型组(n=18)、治疗组(n=18)。模型组以大剂量ISO (100 mg/kg) 100 μL腹腔注射诱导小鼠阵发性房颤的发生，治疗组于造模前0.5 h腹腔注射PNS (150 mg/kg) 100 μL；模型则给予等体积的生理盐水。正常组均给予等体积的生理盐水。

1.3.2 心电图监测 各组随机选取6只C57BL/6雄性小鼠，10%水合氯醛麻醉后，按照说明(Johansson&Thoren 1997)分别于腹部皮下植入ETA- F20植入子(Date Science International，St Paul，MN，USA)。前期实验操作分别检测各组实验动物房颤的发生率[5]。

1.3.3 病理形态学检测 余实验动物均于注射ISO 1.5 h后，取其心脏组织，每组各取6只，4%多聚甲醛固定，4 μm 石蜡切片，分别进行HE染色。并通过Annexin V 荧光探针法进一步评价其细胞凋亡情况。

1.3.4 心脏组织中相关miRNAs的检测 余实验动物，分离其心房组织，严格按照总RNA提取试剂盒(德国，QIAGEN公司)提取总RNA，并按照逆转录试剂盒(德国，QIAGEN公司)进行逆转录，采用SYBG方法进行RT- PCR试验分别检测心房组织中miR- 29b，miR- 210，miR- 499，miR- 328的表达，以5s核糖体RNA作为内参照(引物序列见表1)。

表1 引物序列

2 结 果

2.1 PNS显著预防大剂量ISO所诱导小鼠阵发性房颤的发生 正常组即PNS (- )； ISO (- )为典型正常心电图表现，模型组即PNS (- )； ISO (+)出现典型的阵发性房颤发生的心电图表现，而治疗组即PNS (+)； ISO (+)未见房颤的发生。详见图1。

图1 PNS显著预防大剂量ISO诱导阵发性房颤的发生

2.2 PNS显著改善大剂量ISO诱导心肌细胞凋亡情况 模型组HE染色结果呈现，胞核染色明显，胞核中可见多个核仁，可见核分裂相。进一步统计分析各个心脏石蜡切片全视野中处于核分裂相的细胞核百分比。与正常组相比，模型组心脏石蜡切片中，核分裂相显著增加(P<0.05)；与模型组相比，治疗组核分裂相百分比显著降低(P<0.05)。详见图2。

进一步明确细胞凋亡情况，同时采用Annexin V 荧光染料法以检测细胞早期凋亡。模型组心脏组织中可见大量绿色荧光。量化分析结果提示，与模型组相比，治疗组心脏组织中绿色荧光显著减少(P<0.05)。详见图3。

注：与模型组相比，* P<0.05。

图2 PNS显著减少心脏组织中核分裂相情况(标尺：50 μm)

注：与模型组相比，* P<0.05。

图3 PNS显著减少心肌细胞凋亡情况(标尺：100 μm)

2.3 PNS显著调节心房组织中相关miRNAs的表达 与正常组相比，模型组心房组织中miR- 29b (A) 和miR- 328 (D) 的表达均显著下调，miR- 210 (B) 及miR- 499 (C) 的表达均显著上调(P<0.05)。与模型组相比，PNS(治疗组)显著上调心房组织中miR- 29b (A) 和miR- 328 (D) 的表达(P<0.05)；显著下调心房组织中miR- 210 (B) 及miR- 499 (C)的表达(P<0.05)。详见图4。

注：与正常组相比，* P<0.05，与模型组相比，# P<0.05。

图4 PNS显著调节心房组织中相关miRNAs的表达

3 讨 论

AF是一种最常见的快速室上性心律失常，是血栓、心力衰竭、脑卒中发生最重要的危险因素之一，严重影响着人类健康和生活质量。流行病学调查指出，AF病人远期脑卒中、心力衰竭和全因死亡率风险均显著增加。因此，AF治疗药物及其发病机制的研究依旧是目前研究的重点难点问题。PNS可预防大剂量ISO所诱导的C57BL/6小鼠阵发性房颤的发生，与本课题组前期研究报道结果相似[5]，本次研究在此基础上，结合miRNAs的研究手段进一步探索PNS预防大剂量ISO所诱导房颤发生的潜在的分子机制。

miR- 29b主要表达于心肌成纤维细胞，可直接或间接参与包括胶原蛋白等在内的多种纤维化形成蛋白的表达，抑制心肌纤维化的形成，引起心肌结构重构，是心肌结构重构的重要标志物[8]。且研究表明，miR- 29b在房颤或充血性心力衰竭病人呈现低表达状态[9]。本研究结果提示，PNS可显著上调心房组织中miR- 29b的表达。推测PNS可能通过调节心房组织中miR- 29b的表达进而改善心房组织结构重构，这可能是PNS抗ISO所诱导小鼠阵发性AF发生潜在的分子机制。miR- 210在缺血缺氧情况下的高表达，是诸多心血管疾病发生发展过程中重要的分子机制之一[10- 11]。缺血缺氧进而导致细胞凋亡是诸多疾病发生过程中最初的病理变化，细胞凋亡在生长、发育、衰老、生理病理中起着重要的作用，同样是心肌结构重构发生发展过程中重要的病理基础。且研究表明，在心力衰竭合并房颤的病人中循环miR- 210表达显著增加[12]。本研究结果表明，PNS显著改善心脏组织中细胞核分裂相情况，降低心脏组织中细胞凋亡情况，下调心房组织miR- 210的表达。推测PNS降低细胞凋亡情况可能是其改善心肌结构重构，进而防治AF发生的潜在分子机制。小电导钙离子激活钾通道(small conductance calcium- activated potassium channel 3，SK3)是在房颤发生过程中起着重要作用的离子通道，且研究指出SK3基因敲除可引起小鼠其动作电位的延长进而引发AF发生[13]。KCNN3是SK3通路上重要的调节蛋白，KCNN3在房颤发生过程中起着重要的作用。研究指出miR- 499可直接调控KCNN3以及SK3基因的表达，miR- 499通过下调KCNN3的表达，下调SK3表达，影响SK3通路活性，进而引发房颤的发生[14- 15]。且诸多研究表明，miR- 499在房颤发生发展过程中呈现高表达状态[16]。本研究结果表明，PNS可显著下调心脏组织中miR- 499的表达。推测PNS抗ISO所诱导小鼠阵发性房颤发生的作用可能是通过调节心房组织中miR- 499的表达，改善心房电重构而实现的。

诸多研究指出miR- 328在AF发生发展过程中的重要机制之一[17]。且一项miRNAs与AF发生发展相关性研究指出，在包含有385个miRNAs的高通量筛选中发现只有miR- 328不仅与AF的发生密切相关，且与AF发展进程密切相关[18]。钙离子通路在AF发生过程中同样起着重要的作用，miR- 328可作用于SERCA2a基因，影响细胞内钙离子浓度以及钙调磷酸酶蛋白的表达，影响钙离子通路活性[19]。miR- 328还可作用于CACNA1C及CACNB1基因，影响L型钙通道活性，影响AF的发生发展[20]。本研究结果表明，PNS可显著上调心房组织中miR- 328的表达。推测PNS抗ISO所诱导小鼠阵发性房颤发生的作用可能是通过调节心房组织中miR- 328的表达，进而改善心房电重构而实现的。

PNS显著预防ISO所诱导小鼠阵发性房颤发生的作用机制可能与通过调节心房组织中miR- 29b，miR- 210，miR- 499及miR- 328的表达，改善心房心肌结构重构和电重构而实现。这将为PNS进一步应用于临床抗阵发性房颤的发生提供新的治疗思路及有力的实验依据。

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