响应面优化超声波辅助萃取香根油工艺及其成分研究

王赛丹，陈齐亮，孙认认，李涛，任保增

（郑州大学化工与能源学院，河南郑州450001）

香根草又名岩兰草，是禾木科岩兰属的一种多年生草本植物[1]。原产自斯里兰卡和印度，后被引种到海地、波兰和中国等地并被广泛种植。其根部能散发出怡人的香味，提取得到的香根油，由于味道清新、怡人而被广泛用于香水化妆品工业[2]。目前，已有文献报道关于香根油提取工艺的研究，例如，龚德慎等[3]用水蒸气蒸馏法对黔产香根草蒸馏11 h左右，并用石油醚萃取回收残渣，得香气较好的0.8%的香根油，但提取率较低；Martinez等[4]对巴西产香根草干燥磨粉后分别经液氮碾磨、NaOH溶液及酶处理后，再水蒸气蒸馏16 h，得到提取率约为1.8%的香根油；朱自仁等[5]采用有机溶剂提取法连续浸提两次，提取率达到了15.21%左右，但提取时间较长，且未经除杂处理，所以所得精油颜色较深；本课题组廖耀华等[6]利用超临界CO2萃取法，得到提取率为7.78%的香根油，但是，其提取过程中没有进行除杂、提取工艺比较繁琐、成分分析不够完善。

超声波辅助提取技术是指利用超声波的能量破除植物细胞结构，从而加速溶质溶出扩散，提高植物有效组分从固相到液相的传质速率，实现精油的高效提取[7-8]。本研究以河南南阳地区的香根草为原料，采用超声波辅助有机溶剂法提取法，利用单因素和响应面试验对提取过程进行优化，筛选出香根油的较优提取工艺参数，并对香根油的成分进行比较完善的分析，以期为香根草提取香根油的应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

香根草：采摘自河南南阳淅川县；无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷等试剂均为分析纯。

FA2014N电子分析天平：上海菁海仪器有限公司；SHZ-D（III）真空泵：河南省予华仪器有限公司；KQ-500DE超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；RE-52C旋转蒸发仪：巩义市英峪高科仪器厂；20×200/24层析柱：中原玻璃仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 萃取工艺流程

香根草根须→蒸馏水反复清洗→40℃电热鼓风干燥箱烘干32 h→粉碎过筛→超声波萃取两次→合并提取液→旋转蒸发→少量乙醇溶解→冷冻除杂→微孔滤膜过滤→旋蒸至恒重→计算粗提油提取率→硅胶纯化→流出液体浓缩→计算精油提取率

1.2.2 香根油提取率计算

香根油提取率的计算如式（1）所示：

式中：m1为香根油的质量，g；m2为香根草的质量，g。

1.2.3 单因素试验

选取有机溶剂、粒径、料液比（g/mL）、超声时间（min）和超声温度（℃）5个单因素进行单因素试验。考察各因素对香根草油提取率的影响，试验均平行3次取均值。

1.2.4 响应面试验设计

根据单因素试验结果，以Box-Behnken法进行试验设计，选取料液比、超声时间和和超声温度3个影响因子（其他因子均选择单因素最佳值进行试验），响应值为香根草油的提取率，设计出了三因素三水平的试验，因素水平见表1。并运用Design-Expert.8.06b软件对试验数据进行分析，考察各因素交互作用。

表1 响应面试验因素与水平表Table 1 Variables and levels in the response surface experiment design

1.2.5 验证试验

验证响应面分析得到的最优预测值，平行试验3次，并计算此条件下香根草油的平均提取率，与预测值比较。

1.2.6 GC-MS联用分析香根油成分

色谱分析条件：GsBP-35 ms毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；初始柱温为50℃，程序升温，以15℃/min至160℃，以1℃/min至195℃，以15℃/min至260℃，保持3min，氦气作载气，进样口温度250℃，分流比20∶1，柱流速1.0 mL/min。溶剂延迟：3.2 min。

质谱：EI（70 eV），接口和离子源的温度分别为250℃和220℃，扫描范围：40 aum~500 aum。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 有机溶剂对香根油提取率的影响

在粒径为 80目~100目，料液比 1∶15（g/mL），超声温度50℃，超声时间为30 min条件下，研究不同提取剂对香根草油提取率的影响，试验结果见表2。

由表2可知，不同有机溶剂提取效果不同，正己烷和石油醚为非极性有机溶剂，而香根油中的倍半萜类主要挥发性香气成分一般为弱极性或中等极性的物质，根据相似相溶原理，应较易溶出，故纯化前后提取率变化不大，色泽上为浅黄色油状液体、清澈透明，且有浓郁的木香和厚重的清香，但提取率比较低。当以无水乙醇为溶剂时，香根油的提取率最大为3.02%，而且所得精油色泽澄清透亮、香味浓郁持久，品质较佳，故选取无水乙醇作为提取溶剂。

表2 不同有机溶剂提取香根草精油的效果比较Table 2 The effects comparison of different organic solvent on the extraction of vetiver essential oil

2.1.2 粒径对香根油提取率的影响

以无水乙醇为提取溶剂，其它条件同2.1.1的条件下，研究不同粒径对香根草油提取率的影响，结果见图1。

图1 粒径对香根草油提取率的影响Fig.1 Effect of grinding granularity on yield of vetiver essential oil

由图1可知，香根草精油的提取率随粒径目数的增大而呈上升趋势，当粒径为80目~100目时，提取率为3.08%，继续增大粒径目数时，提取率基本保持不变，而且会提高研磨粉碎成本，故本试验选择粒径为80目~100目。

2.1.3 料液比对香根油提取率的影响

在粒径为80目~100目，其它条件同2.1.2时，研究不同料液比对香根草油提取率的影响，结果见图2。

图2 料液比对香根油提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on yield of vetiver essential oil

由图2知，当料液比低于1∶10（g/mL）时，香根油提取率随着料液比的增大而增加，在1∶10（g/mL）时达到最大，为3.01%。这可能是因为增加溶剂用量时，溶剂中香根油的浓度会降低，从而增大了香根草精油与溶剂接触界面处的浓度差，即增大了传质推动力，提高了传质速率[9]。随着料液比的增加，不仅会增加溶剂用量造成不必要的浪费，而且会增加旋蒸浓缩时间，造成精油在溶剂中的挥发损失。故综合考虑，选择料液比为 1∶10（g/mL）。

2.1.4 超声时间对香根油提取率的影响

在料液比 1∶10（g/mL），其它条件同 2.1.3 时，考察不同超声时间对香根草油提取率的影响，结果如图3。

图3 超声时间对香根草油提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on yield of vetiver essential oil

由图3知，随着超声时间的增加，香根草油的提取率呈现上升趋势，在30 min时达到最大，为3.07%。这是因为随着超声时间的延长，会加剧细胞破碎度，利于香根草油在有机溶剂中的溶出。而继续延迟超声处理时间，香根草油的提取率基本保持不变。因此，超声处理时间选择30 min。

2.1.5 超声温度对香根油提取率的影响

在超声时间为30 min，其它条件同2.1.4时，考察不同提取温度对香根草油提取率的影响，结果见图4。

由图4知，香根油提取率随着超声温度的增加而增加，在60℃时达到最大，为3.34%。继续增加温度，提取率反而下降。这可能是因为，当温度过高时，会导致香根草油中热敏性物质的氧化及挥发，从而造成提取率的下降。另外，升高温度则会加大能耗和成本，故综合考虑选择超声温度为60℃。

图4 超声温度对香根草油提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on yield of vetiver essential oil

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验结果与方差分析

根据单因素的试验结果，利用Design－Expert 8.0.6软件中的Box－Behnken模型进行响应面试验设计，因素与水平见表1，试验过程中选取料液比、超声温度、超声时间为响应变量，以硅胶纯化后的香根油的提取率为响应值。试验方案及结果如表3所示，对表3中的数据进行多元二次回归拟合，所得回归方程如下式2，其中提取率（%）记作Y，回归方程的方差分析结果见表4。

表3 Box-Behnken试验设计与结果Table 3 Box-Behnken design with experimental results

表4是该模型的回归方差分析表。

表4 回归方程方差分析Table 4 Analysis of variance for the developed regression equation

从表4中可以得出，二次回归模型的F值是34.05，P＜0.000 1，表明该二次回归模型达到了极其显著水平，可以用该模型来描述响应值与各个因素之间的函数关系；失拟项P=0.110 7＞0.05，表明失拟项不显著，该模型可以充分反映实际情况；试验模型的相关系数R2为0.977 7，表明试验结果与该二次回归模型得到的预测结果差异较小，两者有着良好的一直性，该模型的校正系数RAdj2=0.949 0，表明响应值的变化受所选试验因素影响较大。因此，可以用该模型对香根草油提取率的结果进行预测和分析。表4中F值的大小可以判断自变量对因变量的影响程度大小，由此可以得出各因素对香根草油提取率的影响主次顺序是A＞C＞B，即在所选定的试验范围内料液比对香根草油提取率的影响最大，其次是超声温度，超声时间对香根草油提取率的影响最小。由表还可以看出，一次项中超声温度和料液比对香根草油提取率的影响达到极显著水平（P＜0.01），超声时间对香根草油的提取率影响达到显著水平（P＜0.05）；该模型的交互项中AC香根草油的提取率影响达到显著水平（P＜0.05），表明超声温度和料液比之间存在着显著的交互作用；二次项中A2和C2对香根草油提取率的影响达到极显著水平（P＜0.01）。

2.2.2 响应面分析

各因素交互作用对香根油提取率的影响见图5。

响应面是描述在其它因素恒定的情况下，来考察两个因素的交互作用对响应值的影响，响应面的坡度越陡峭对响应值的影响就越显著，当响应面的等高线越接近椭圆时，表明两因素的交互作用越显著[10-11]。

图5 各因素交互作用对香根油提取率的影响Fig.5 Response surface graphs showing the effect of extraction conditions on the yield of vetiver oil

图5 A~C是反应各因素交互作用对香根油提取率的影响。其中图5 A是显示在超声温度为60℃时，料液比和超声时间对香根草油提取率的影响，由图可知：香根草油的提取率随着料液比和超声时间的增加均有先增加后减小的趋势，表明两者对香根草油提取率的影响均显著，与方差分析结果一致，其中，料液比的变化曲面比超声时间的变化曲面更为陡峭，表明料液比对香根草油的提取率的影响更为显著；图5 B是在超声时间为30 min时，料液比和超声温度对香根草油提取率的影响，由图可知两者的变化曲面都很陡峭，表明料液比和超声温度对香根油的提取均极其显著；图5 C是在料液比为30 min时，超声温度和时间对香根草油提取率的影响，由图可知随着温度和时间的增加，香根草油的提取率先增加后减小，而且超声温度的变化曲面更为陡峭一些，表明超声温度对香根草油的提取率更为显著一些，与方差分析结果一致。由图5 A~C的底部等高线投影图中可以看出，B中的等高线更接近于椭圆[12]，表明料液比和超声温度交互作用较为显著，对香根草油提取率的影响结果较大。

2.2.3 最优点验证

利用Design-Expert 8.0.6软件得到香根油的较优提取工艺参数分别为料液比为1∶12.22（g/mL）、超声提取时间35 min、提取温度67.92℃，香根油的提取率最大达到3.35%。鉴于实际的生产过程，将较优工艺参数进行一些调整，调整后的提取工艺参数分别为料液比为1∶12（g/mL）、超声提取时间35 min、提取温度68℃，在此工艺参数下，平行进行3次试验，得到香根油的提取率为3.21%，和模型预测值3.35%非常接近，表明这个模型可以很有效的评价香根油的提取过程。

2.2.4 香根油的GC-MS分析

超声波辅助有机溶剂法提取香根油的总离子流色谱图如图6所示。

所得质谱图谱经数据库检索对照、人工图谱分析及可靠性筛选后，初步确认了其中部分主要目标组分的化学成分，分析结果如表5所示。

通过气相色谱-质谱联用对最优工艺参数下制备的香根油进行化学成分分析，结果如图6和表5所示。从超声波辅助溶剂提取法制得香根油中共鉴定出22种相对百分含量较多的目标组分，几乎均为倍半萜及其氧化物，占气相出峰总萃取物的76.96%。其中[13-15]属于倍半萜醇类的化合物7种，总相对含量为33.95%，它们分别是：β-桉叶醇、胡木烷 -1，6-二烯-3-醇、?客素醇、α-异杜松醇、岩兰醇、客烯醇和异朱栾倍半萜醇；属于倍半萜酮类的化合物7种，总相对含量为22.28% ， 它 们 分 别 是 ：4αβ 甲 基 - 反 -3，4，4a，5，6，7，8，9-四氢-2H-苯并环丁烯-2-酮、菖蒲螺烯酮、长叶松香芹酮、β-岩兰酮、香柏酮、α-岩兰酮及倍半萜烯酮；属于倍半萜羧酸类的化合物1种，即岩兰酸，占总相对含量的12.87%；属于倍半萜烯烃的化合物烃类的化合物7种，总相对含量为7.83%，它们分别是：α-紫穗槐烯、佛术烯、β-杜松烯、β-朱栾、α-愈创木烯、长叶烯和δ-桉叶烯。这些被鉴定出的化学组分多是各种食品添加剂、香料、中草药等的有效组分，如β-岩兰酮带有浓郁的木质异香的果香儿，可用于制备一些特殊的香料。

图6 超声波辅助有机溶剂法提取香根草油的总离子流色谱图Fig.6 Ultrasonic assisted organic solvent extraction of vetiver oil total ion current chromatogram

表5 超声波辅助有机溶剂法提取提取香根草油的GC-MS分析结果Table 5 The GC-MS analysis results of vetiver oil

3 结论

以河南南阳香根草为原料，利用超声波辅助有机溶剂萃取法提取香根油，得到其较优的工艺参数：料液比为1∶12（g/mL），超声时间为35 min，超声温度为68℃。在此工艺参数条件下，平行试验3次得到香根油的提取率为3.21%。响应面结果表明，3个因素对香根油提取率影响大小顺序为：料液比＞超声温度＞超声时间，其中料液比和超声温度两个因素的交互作用较为显著。采用气相色谱－质谱联用分析技术对纯化后得到的香根草油进行了成分分析，初步确定了其中22种主要组分化合物及各组分的相对百分含量。本研究提取工艺简单，条件温和，可为南阳等地的香根草综合利用提供试验参考。

[1] 毛萍,杨宏,马欣荣.香根草的研究及利用进展[J].中国农业科技导报,2011,13(1):88－93

[2] Danha L T,Truongc P,Mammucaria R,et al.Extraction of vetiver essential oil by ethanol－modified supercritical carbon dioxide[J].Chemical Engineering Journal,2010,165(1):26－34

[3] 龚德慎,魏德生,钟雁,等.黔产香根油的研究[J].贵州科学,1997,15(2):126－130

[4] Martinez J,Rosa P T,Menut C,et al.Valorization of Brazilian Vetiver(Vetiver zizanioides(L.)Nash ex Small)Oil[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,52(21):6578－6584

[5] 朱自仁,何有昌,张淑.香根油的提取和浸膏的试制试验报告[J].四川日化,1990(4):38－41

[6]廖耀华,王丹,王宝庆,等.响应面试验优化香根草油的超临界CO2萃取工艺及其萃取物分析[J].食品科学,2015,36(20):79－85

[7] Tekin K,Akalln M K,■eker M G.Ultrasound bath－assisted extraction of essential oils from clove using central composite design[J].Industrial Crops&Products,2015,77:954－960

[8] 袁敏,郭应贵,杨兴兵.超声波提取花椒挥发油的研究[J].广州化工,2010,38(1):98－99

[9] Hugenholtz J,Sybesma W,Groot M N,et al.Metabolic engineering of lactic acid bacteria for the production of nutraceuticals[J].Antonie Van Leeuwenhoek,2002,82(1/4):217

[10]张声源,邹浩元,杨宇辉,等.响应面法优化金柚核中类柠檬苦素的提取工艺[J].食品研究与开发,2017,38(9):65－69

[11]Dong C H,Xie X Q,Wang X L,et al.Application of Box－Behnken design in optimisation for polysaccharides extraction from cultured mycelium of Cordyceps sinensis[J].Food&Bioproducts Processing,2009,87(2):139－144

[12]李斌,雷月,孟宪军,等.响应面试验优化超声波辅助提取蓝靛果多酚工艺及其抗氧化活性[J].食品科学,2015,36(22):33－39

[13]Weyerstahl P,Marschall H,Splittgerber U,et al.Constituents of Haitian vetiver oil[J].Flavour&Fragrance Journal,2000,15(6):395－412

[14]Peter W,Helga M,Ute S,et al.Analysis of the polar fraction of Haitian vetiver oil[J].Flavour&Fragrance Journal,2000,15(3):153－173

[15]Celestino R S,Zucchi M I,Pinheiro J B,et al.Molecular and chemical characterization of vetiver,Chrysopogon zizanioides(L.)Roberty,germplasm[J].Genetics&Molecular Research Gmr,2015,14(3):9452－9468

[16]Lavania U C.Other Uses,and Utilization of Vetiver:Vetiver Oil[C].Guangzhou:The Third Int.Conference on Vetiver and Exhibition,2003:486－491

[17]Paillat L,Périchet C,Pierrat J P,et al.Purification of vetiver alcohols and esters for quantitative high－performance thin－layer chromatography determination in Haitian vetiver essential oils and vetiver acetates[J].Journal of Chromatography A,2012,1241(11):103－111