6种食用香辛料提取物对食源性致病菌和益生菌的不同作用

谢强，苗淑萍，史守纪，陈金标，夏秀华（无锡商业职业技术学院，江苏无锡214153）

随着科技的迅猛发展，食品工业产值增长以其远远超过GDP的增长速度快速增长。然而，食品工业的发展离不开食品防腐剂的保驾护航。市场上使用的食品防腐剂主要分为化学合成与天然提取物两大类。目前，化学防腐剂在应用中依然占据统治地位，这与人们日益增长的食品安全意识与绿色饮食观念形成矛盾。于是，从自然界开发获得天然食品防腐剂成为科学工作者关注的热点，也是今后防腐剂发展的主要方向。天然食品防腐剂根据来源不同可分为植物源、微生物源和动物源3大类。天然植物以其丰富的资源和高效低毒的特性，在食品行业中的研究和应用越来越广泛。食用香辛料自然成为备受关注的一类，目前研究报道具有抗菌防腐作用，可以作为防腐保鲜剂的食用香辛料有肉桂、八角、牛至、香叶、百里香、迷迭香、香茅草、丁香、花椒、紫苏、香芹等几十种[1-3]。然而肠道益生菌与人类健康的关系早已成为本世纪以来生命科学领域的热门话题。科学研究者筛选天然食品防腐剂只关注其对有害菌的抑制作用，是否这些防腐剂也抑制益生菌增殖，或者靶向抑制有害菌而对益生菌没有作用，甚至促进益生菌增殖，近年一些研究报道了食用香料能够促进益生菌的生长[4]，更多的研究需要筛选验证食用香料对食源性致病菌和益生菌的双向作用。基于此，本文选取6种常用香料为研究对象，选取4株食源性致病菌和4株益生菌为受试菌株，探究香料水提物对两类菌的抑制效果，为筛选评价既能防腐保鲜又能促进肠道菌群健康的天然香料做理论探讨。

1 材料与方法

1.1 试剂与菌种

肉桂（樟科，樟属，肉桂种，产自广西）、白胡椒（胡椒科，胡椒属，胡椒种，产自广西）、花椒（芸香科，花椒属，花椒种，产自四川）、孜然（伞形科，孜然芹属，孜然芹种，产自新疆）、八角（八角科，八角属，八角种，产自广西）、香叶（樟科，月桂属，月桂种，产自广东）：无锡市农贸市场。MRS、MH肉汤培养基：北京鼎国生物科技有限公司。本次试验所用的4株益生菌分别为副干酪乳杆菌 （L.paracasei JLUS66）、嗜酸乳杆菌（L.acidophilus JLUS37）、植物乳杆菌（L.plantarum JLUS78）、鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus JLUS46）菌：由吉林大学食品学院分离鉴定储存并友情馈赠。4株食源性致病菌包括大肠杆菌（E.coli ATCC 8735）、金黄色葡萄球菌（S.aureusATCC3101）、鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）：由吉林大学人兽共患病研究所储存并友情馈赠。

1.2 仪器设备

高压蒸汽灭菌锅（MLS-3750型）：三洋电机株式会社；生化培养箱（spx-250B-Z型）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；生物安全柜（05J02-C型）：苏州净化设备有限公司；酶标仪（FC型）：上海赛默飞世尔有限公司；真空冷冻干燥机（ES-2030型）：日本日立公司。

1.3 天然植物（香辛料）粗提物及溶液制备

桂皮、白胡椒、花椒、孜然、八角和香叶在40℃干燥箱烘干24 h，经粉碎处理过80目筛，各称取50.0 g粉末于烧杯中，与蒸馏水按料液比为1∶10（g/mL）进行混合后，置于60℃恒温水浴锅中提取8 h，离心取上清，将上清液用悬蒸法在60℃温度下，浓缩4 h。将浓缩得到的液体转平皿中，冷冻干燥得到粉末状的粗提物。

提取物溶液的配置：分别称取6种粉末状粗提物250.0 mg，配制成5 mg/mL的储备溶液，并用0.22 μm滤膜过滤，置于50 mL离心管中，用封口膜封口，置于4℃冰箱中备用。

1.4 试验菌悬液的制备

从4℃冰箱储存的固体琼脂板上挑取单菌落，益生菌接种在MRS液体培养基中，致病菌接种在MH肉汤培养基中，于恒温培养箱37℃培养24 h～48 h至对数生长期，待用。

1.5 抑菌活性检测

1.5.1 抑菌圈（DIZ）的测定

DIZ的测定采用双层琼脂扩散法，先以1%的无菌琼脂水溶液在培养皿底层打底，待琼脂凝固后均匀摆放牛津杯，再倒20 mL带有指示菌的固体培养基，待培养基凝固后取牛津杯，在其形成的孔内加0.2 mL各香料粗提物溶液，37℃培养24 h后测DIZ直径，单位为mm，DIZ小于8 mm判定为无抑菌圈（NIZ）。

1.5.2 最小抑菌浓度（MIC）的测定

最小抑菌浓度测定采用标准肉汤稀释法[5]，将复苏培养后的菌悬液用麦氏比浊法稀释到1×105cfu/mL，用移液器取100 μL分别加入96孔板的中间的6×10孔，周围36孔加无菌水保湿。将5 mg/mL的香料提取物溶液用灭菌蒸馏水二倍稀释，得到浓度梯度为5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.078 1、0.039 1 mg/mL的稀释液液，分别取100 μL加入96孔板加过菌悬液的各孔，每个浓度梯度加一排6个孔，各受试组实际药物终浓度分别为2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.078 1、0.039 1、0.019 5 mg/mL。青霉素做阳性对照。37℃培养24 h后，用MTT进行活细胞染色，肉眼观察无显色反应的最小药物浓度孔的药物浓度判断为MIC。

1.5.3 最小杀菌浓度（MBC）的测定

MBC的测定参照代如意[6]的方法。将MIC检测中未见细菌生长的各孔菌液，采用平板涂布法进行计数，以肉眼观察菌落不生长视为100%被杀灭，此最低药物浓度值为其MBC值。

1.6 统计

所用试验分别做3个平行，使用SPSS19.0统计软件，抑菌圈值用±SD表示。

2 结果

6种食用香料粗提物对4株食源性致病菌的抑菌活性及对4种益生菌的作用见表1、表2。

表1 6种食用香辛料粗提物对4株食源性致病菌的抑菌活性Table 1 Antibacterial activities of 6 kinds of food spices extracts on 4 foodborne pathogens

表2 6种香辛料提取物对4种益生菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activities of 6 kinds of food spices extracts on 4 probiotics

2.1 抑菌圈测定

双层琼脂扩散法测定6种食用香料提取物对4种食源性致病菌均表现出抑菌活性。如表1所示，肉桂、八角和香叶提取物对该4种食源性致病菌的抑菌圈较大 。 肉 桂 提 取 物 对 B.subtilis、E.coli、S.aureus、S.typhimurium4种菌的抑菌圈分别为（17.3±1.5）mm、（18.5±1.0）mm、（14.7±1.1）mm、（10.2±0.9）mm，抑菌活性最强。白胡椒、花椒和孜然对4种菌都产生相对较小的抑菌圈（8.6±0.5）mm～（11.2±1.3）mm，而鼠伤寒沙门菌对花椒、孜然和香叶提取物均不敏感，没有抑菌圈出现。相反的，在6种香料提取物对4种益生菌的抑菌圈试验中，除植物乳杆菌表现对肉桂、八角和香叶提取物敏感，都出现了抑菌圈，分别为（9.1±0.60）mm、（10.2±1.6）mm、（8.7±0.9）mm。其他均未见明显抑菌圈（见表2）。

2.2 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定

微量肉汤稀释法测定6种香料提取物对4株食源性致病菌和4株益生菌的结果与抑菌圈测定结果基本对应。从表1可见，肉桂、八角和香叶提取物对4种食源性致病菌的MIC值分别为0.625、0.625 mg/mL和1.25 mg/mL，表现出较强的抑菌活性。白胡椒、花椒和孜然提取物对4种食源性致病菌的MIC值都≥2.5 mg/mL。肉桂和八角对4种致病菌的MBC值，除肉桂对 S.aureus外（0.625 mg/mL）都是 1.25 mg/mL，其余都为获得明确的MBC值都≥2.5 mg/mL。6种提取物对4种益生菌的MIC值和MBC值都2.5 mg/mL。

3 讨论

目前有114个品种的香辛料经由国际标准化组织（ISO）确认并列入标准[5]。因其秉承了“药食同源”的传统饮食观念，近年来，国内外学者对香辛料的化学成分和生物活性进行了广泛而深入的研究，其中抗氧化和抗菌活性是主要的研究热点。天然食用香辛料中含有多种抗菌活性成分。本研究采用水提法获得6种食用香料粗提物，经抑菌圈实验，MIC和MBC测定，6种粗提物对4种常见食品腐败菌和致病菌都表现出抑菌活性。其中肉桂提取物的抑菌活性最强，对4种致病菌和腐败菌的MIC均是0.625 mg/mL。肉桂含有肉桂醛、肉桂酸等多种抗菌成分，被许多报道验证。何珊等[8]采用硅胶柱色谱等多种色谱分离技术从肉桂的乙醇提取物中分离得到香豆素、肉桂酸、2－羟基－4－甲氧基肉桂醛等12种化合物。张赟彬等[9]用滤纸片法测得肉桂醛对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别为21.75、29.37 mm，MIC 值和 MBC 值分别为 0.25 μL/mL和0.5 μL/mL。南洋等[10]从肉桂醇提取物中鉴定出香豆素、桂皮醇、桂皮醛、桂皮酸、2－甲氧基桂皮醛、十八烷二烯酸甲酯6种化学成分。其提取物对肉中常见的腐败菌和致病菌包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、青霉菌、啤酒酵母均有较强的抑制作用。杨敏等[11]用不同有机相提取胡椒中的抗菌成分，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等5株受试菌的MIC值为2.5 mg/mL～20 mg/mL。麻琳等[12]采用水蒸气蒸馏法提取汉源红花椒、江津青花椒、峨眉山藤椒果皮精油，经GC－MS分析芳樟醇是3种精油的主要挥发性成分，并通过抑菌圈实验和二倍稀释法研究其抑菌特性，经比较，金黄色葡萄球菌对红花椒精油最敏感，MIC值为0.31 mg/mL。有研究报道[13]，孜然中的主要抑菌成分为枯茗醛和枯茗酸。王同禹等分析八角茴香水溶性挥发组分的主要成分为大茴香醛、对丙酮基茴香醚和大茴香酸。八角茴香水溶性挥发成分对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、黑曲霉、黄曲霉和桔青霉的最小抑菌浓度分别为0.625 mL/L～20 mL/L[14]。唐晖慧[15]采用水蒸气蒸馏法收集艾纳香叶精油，对金黄色葡萄球菌的MIC为625 μg/mL，对大肠杆菌、李斯特氏菌和沙门氏菌的MIC为2 500 μg/mL。本文的研究结果与这些报道基本吻合，却并非报道中都得到了很高的抗菌活性，这可能是不同的提取方法获得有效成分差异。

益生菌是指一类能够在人体肠道生存，并能够通过各种调节功能改善人体健康的一类健康菌群。益生菌被誉为是人体“第二大脑”，研究表明，益生菌有抗过敏、调节肠道功能，增强免疫，甚至是降糖、降压、抗肿瘤，治疗获得性免疫缺陷综合征（AIDS）、中枢神经系统（CNS）疾病等功效[16]。医学界始终关注抗生素的大量使用会破坏人体肠道菌群，然而对食品中使用的防腐剂是否能够破坏肠道菌群却很少关注。从天然植物原料筛选被认为是安全绿色的食品防腐剂的同时，兼顾考虑其对肠道菌群的作用意义深远。本文比较了6种食用香料分别对食源性致病菌和益生菌的不同作用。结果表明6种食用香料提取物能够抑制有害菌，然而除八角、香叶提取物对植物乳杆菌出现较小的抑菌圈外[（10.2±1.6）mm，（8.7±0.9）mm]，其他都没有发现对受试益生菌产生抑制。在本试验浓度范围内，所有提取物对受试益生菌株都没有获得MIC和MBC值（均＞2.5 mg/mL），这是令人可喜的。一些学者也曾得到过类似的结果。Puupponen等[17]研究表明，浆果多酚类化合物能够选择性抑制沙门氏菌和表皮葡萄球菌，却对乳酸杆菌没有作用。Lee等[18]研究茶多酚也获得类似结果。许多研究证明石榴皮提取物的抑菌活性[19]，而Bialonska等报道石榴皮提取物对嗜酸乳杆菌，干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌都没有抑制作用。为什么致病菌比乳酸菌对这些天然抑菌成分更为敏感，这是值得深入探讨的问题。其可能机制为，一方面，益生菌本身在发酵过程中能够产酸，带有与身俱来的耐酸机制[21]；另一方面，可能是益生菌能够代谢解毒天然植物中的酚醛成分[22]。更多的机制需要进一步研究。

4 结论

本研究用水提法获得6种食用香辛料的水提物，并分别利用抑菌圈试验，最小抑菌浓度和最小杀菌浓度检测了6种水提物分别对4种食源性致病菌和4种益生菌的抑制活性。结果表明，除花椒、孜然和香叶提取物对鼠伤寒沙门氏菌未见明显抑制作用，其他提取成分对4种食源性致病菌都表现明显抑制作用。而对4种益生菌的试验结果表明，除肉桂、八角和香叶提取物对植物乳杆菌表现抑制作用，6种水提物对其他3种益生菌均未见明显抑制作用。因此可以认为，许多食用香料提取成分能够选择性的抑制有害菌而不抑制有益菌，从自然界的植物中筛选开发天然食品防腐剂能给人们带来实实在在健康安全的食品。

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