DNA损伤修复的分子机理研究进展*

宋 囡 综述，石 磊 审校

1 染色质化的DNA损伤

真核生物的基因组DNA在细胞核中是高度折叠和有序组织的[1]。为了实现这种三维构象，DNA以染色质的形式包裹围绕在组蛋白上[2-3]。染色质纤维具有不同程度的压缩和不同类型的化学修饰，从而能够保证正确的基因表达以及基因组结构的完整性[1]。染色质DNA的完整性很容易受到外源性和内源性损伤影响。外源性或环境的损伤可能来自太阳光中的紫外线（UV），电离辐射（IR，例如来自宇宙辐射和医疗用X射线或放射治疗）以及遗传毒性致癌物质，包括拓扑异构酶抑制剂喜树碱（CPT，拓扑异构酶I抑制剂）和依托泊苷（Etoposide，拓扑异构酶II抑制剂）[4]。最常见的细胞内源性的基因毒性压力包括由于细胞呼吸作用增加而产生的过量氧自由基，由细胞分裂异常导致的DNA复制叉崩溃，减数分裂过程中的染色体互换，以及脊椎动物淋巴细胞免疫球蛋白基因的染色体重排[5]。

2 DNA损伤修复途径

为对抗DNA损伤，细胞进化出复杂而精细调控的机制去修复不同类型的DNA损伤。目前数百个与DNA损伤修复相关的基因已被确定，它们主要参与了五个不同的，但功能上又相互关联的途径：碱基切除修复(base excision repair,BER)，核苷酸切除修复（nucleotide excision repair,NER），错配修复（mismatch repair,MMR），非同源末端连接（non-homologous end joining,NHEJ）和同源重组（homologous recombination,HR）。

2.1 碱基切除修复（BER）

化学修饰产生的单个碱基损伤会影响碱基形成氢键的能力，导致碱基配对错误。这些突变可能由IR，拓扑异构酶I或一些抗代谢药物所诱导产生，并且主要是通过BER途径修复（图1A）。BER途径的关键成分是糖基化酶，核酸内切酶，DNA聚合酶和DNA连接酶，它们与多聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）和PARP2一起完成这一过程[6]。损伤的碱基首先被糖基化酶和核酸内切酶去除从而形成无碱基位点并且产生一个“缺口”或一个单链断裂，接下来可能通过短一点的BER修复（单个核苷酸被替换）或长一点的BER修复（有2～10新的核苷酸合成）所加工处理[7]。

图1 BER和NER

（A）在碱基切除修复（BER）的第一步，脱氨基碱是由特定的糖基化酶去除。由此产生的嘌呤或嘧啶位点进一步被核酸内切酶水解。DNA链中的缺口之后由DNA聚合酶和DNA连接酶修复。（B）在识别受损DNA链后，核苷酸切除修复（NER）的执行主要包括以下几个方面：转录因子TFIIH介导的双切除，DNA聚合酶，连接依赖DNA连接酶1，Flap内切酶1和Ligase-III-XRCC1复合物来填补缺口，从而完成核苷酸切除修复（NER）。

2.2 核苷酸切除修复（NER）

NER的作用是去除DNA上的螺旋结构扭曲产物，这些产物可能是紫外线辐射或吸烟引起的。着色性干皮病（XP）蛋白和科凯恩综合征（CS）相关蛋白在该通路起着关键作用[7]。真核生物的NER可分为两个子途径：全基因组NER（GG-NER）和转录偶联的NER（TC-NER）。对于每条子通路来说，由两组不同的蛋白质参与识别DNA损伤[7]。之后，两条子通路的后续步骤是相同的：都是由转录因子II H（TFIIH）造成双切口，之后通过DNA聚合酶和DNA连接酶1，Flap核酸内切酶1（FEN1）或LIGIII-XRCC1复合物去封闭“缺口”从而完成核苷酸切除修复（图1B）。

2.3 错配修复（MMR）

错配修复是一种识别和修复子链中特定复制错误的系统，如错误的核苷酸掺入（错配），核苷酸的插入或缺失。错配或不正确的核苷酸能够被MSH2-MSH6异二聚体识别，而缺失和插入的核苷酸能够被MSH2-MSH3异二聚体所识别[6,8]。除了特定的错配修复因子如MLH1-MLH3异二聚体需要处理下游信号外，其他的DNA修复途径的组分包括核酸内切酶1（Endonuclease 1），复制蛋白A（RPA）、增殖细胞核抗原（PCNA）和Flap内切酶1（FEN1）也参与了损伤后的切除和再合成过程。错配修复缺陷导致增加突变率高达1000倍，可以导致微卫星不稳定性（microsatellite instability,MSI）和癌症发生[9]。

2.4 非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）

DNA双链断裂（Double-strand break,DSB）是最严重的损伤形式，无法修复的DNA双链断裂会导致细胞死亡，而且其异常的修复可能会导致染色体的缺失转位等变化。DSB修复一般是通过以下两个主要途径之一进行修复：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HR）。非同源末端连接修复（NHEJ）是极其容易出错的一种修复方式，它通过末端处理加工将断裂的DNA结合在一起，但是末端处理过程中会导致一部分DNA片段的缺失。同源重组修复（HR）使用未受干扰的正确的模板DNA来恢复原来的DNA序列，同源模板一般由姐妹染色单体提供[7,9]（图2）。NHEJ发生在细胞周期的各个阶段，主要在细胞周期的G0期和G1期，它能快速修复高达85%的IR造成的DNA双链断裂损伤。虽然HR通常仅在细胞周期的S和G2期发挥作用，并且只修复部分DNA双链断裂损伤，但是他可能是最重要的修复方式，因为它在处理停滞和崩溃的复制叉以及DNA双链断裂损伤时，是高保真的，而且与NER以及Fanconi anaemia通路共同参与处理链间交联（Interstrand-cross link,ICL）[6]。在HR过程中，DNA双链损伤经过末端切除产生单链DNA，从而侵入同源DNA，使受损的DNA链重新合成[8]。

图2 DNA双链断裂DSB修复和DNA损伤应答（DDR）

DNA损伤应答反应（DDR）是一个感知损伤和启动一系列精密事件的信号转导通路。DDR通常由MRN（MRE11-RAD50-NBS1）复合物识别损伤位点起始，进而招募和激活DDR信号通路关键激酶ATM。之后ATM磷酸化组蛋白突变体H2AX（在人类中是S139位，简称γ-H2AX），为MDC1提供一个高度亲和的结合位点，从而协调了不同功能的与DNA双链断裂修复相关的下游因子，包括泛素化酶RNF8和RNF168。越来越多的证据表明，在损伤位点附近的染色质微环境中，应答和修复复合物的装配具有时空特异性和高度协调性。很多在化学或物理上以可逆的方式修饰染色质结构的酶复合物，例如Nucleosome Remodeling and Deacetylase(NuRD)复合物和Polycomb Repressive Complex(PRC1/2)，已经被阐明是重要的DSB应答修复因子。DSB修复通常通过NHEJ和HR修复途径完成：NHEJ在细胞周期的所有阶段修复DSB，而HR则依赖于一个同源DNA模板的存在，因此通常仅限于S期和G2期。

3 染色质环境下的DNA损伤应答、修复

DNA损伤处的不恰当修复不仅破坏了基因组完整性，而且对DNA复制和基因转录等DNA其他活动有着不良影响，最终会导致基因突变和染色体畸型[10]。因此，细胞通过时间和空间上调控DNA损伤应答（DNA damage response,DDR）来维持基因组完整性的能力对于细胞的内稳态是至关重要的。DNA损伤应答起始主要由磷脂酰肌醇3-激酶样蛋白激酶（PIKKs）家族蛋白ATM、ATR、和DNA-PK以及PARP家族中的PARP1和PARP2成员来介导完成[11]。这些因子通过检测/识别特定的DNA损伤信号，通过精密的协同调节方式，来激活DNA损伤应答反应[4]。DNA损伤应答起始过程活化后，损伤修复是在染色之微环境下通过大量的酶促反应来完成的，它们在化学或物理上可逆地修饰修复蛋白和染色质结构（图2）。这些酶包括但不限于核酸酶，解旋酶、聚合酶、拓扑异构酶，重组酶，连接酶，糖基化酶、甲基化、去甲基化酶、泛素连接酶，去泛素化酶激酶和磷酸酶[1,12,16]。除了这些酶，许多DNA损伤应答或修复过程涉及到支架蛋白，支架蛋白缺乏内在的催化功能或DNA结合功能，但能通过不同的识别结构域，或者通过组装蛋白质复合物，来识别特定的化学修饰，进而参与应答修复过程的完成。为了及时有效地应对损伤刺激和高保真地恢复损伤，在染色质稳态微环境中这些损伤修复工具以及它们的调控因子在时间和空间上必须精确调节，否则每个步骤的失控都有可能对DNA的完整性造成严重破坏，并影响损伤位点近端或远端的染色质结构[17-18]

4 小结

虽然目前已经有很多的工作来研究DNA修复因子招募到DNA损伤位点的调控，以及DNA修复途径的选择性所涉及的细胞机制，但是在染色质环境中DNA修复的分子机制和影响才刚刚开始被理解。近来，一些在肿瘤中异常表达的表观遗传修饰因子，被证明参与了肿瘤细胞的DNA损伤修复过程[9]。由于靶向表观遗传因子已经被证明在肿瘤治疗过程中有着重要的临床应用价值[19]，我们推测，在肿瘤治疗过程中，联合放化疗和抑制肿瘤细胞中导致损伤应答修复活跃的表观遗传因子，包括酶分子或染色质结合蛋白，可以更好的杀伤肿瘤细胞，增强肿瘤细胞放化疗的敏感性。

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