转录因子FOXM1与PCNA在食管鳞癌中的表达及意义*

梁冠男，何雪梅，唐 利，宋雪琴，陈 庄

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，包括鳞状上皮细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)两种组织类型，其发病率和死亡率在世界消化道肿瘤中分列第6位和第4位[1]，ESCC在我国食管癌患者中约占90%[2]。细胞异常增殖是伴随肿瘤发生和发展过程最典型的细胞学变化，肿瘤组织中多种转录因子存在突变、表达或功能异常，促进肿瘤的增殖和侵袭转移。叉头框转录因子M1（forkhead box protein M1,FOXM1）是一种已经被研究证实与细胞增殖相关的叉头框转录因子，它通过转录调控作用于G1/S期、G2/M期来控制细胞有丝分裂的有序进行。已有研究证明，FOXM1表达量的异常改变与多种肿瘤发生和转移有关[1]。增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA)因存在于增殖细胞核而得名，通过检测PCNA的表达量可以辅助性判断细胞增殖状态，但在不同肿瘤及癌症组织中PCNA表达存在一定差异。FOXM1与PCNA均可影响细胞增殖，二者在食管鳞癌中的表达是否具有关联性尚不清楚。在本研究中，我们检测了FOXM1和PCNA在食管鳞癌组织中的表达，并分析了食管鳞癌组织中FOXM1和PCNA的相关性，为临床诊治提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料

研究对象为2012年6月至2013年9月在西南医科大学附属医院胸外科住院治疗，经HE染色判定为食管鳞癌的46例手术病例样本（男性41例，女性5例），患者年龄44～79岁，平均年龄（60.9± 8.1）岁。分别收集癌组织、癌旁组织（距离癌组织2 cm）以及远端正常组织（癌组织5 cm以外），4%多聚甲醛固定后常规石蜡包埋备用。所有患者均经过术前影像学以及病理学检查，且入院前未进行放化疗。样本采集均通过医院学术伦理委员会审查并签署患者知情同意书。

1.2 主要试剂

兔抗人多克隆抗体FOXM1（Santa Cruz,Califor⁃nia,USA），鼠抗人单克隆抗体PCNA（中杉金桥,北京,中国），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔或抗鼠抗体、SP试剂盒以及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物公司。

1.3 免疫组织化学染色

每例样本行苏木精-伊红（H&E）染色经两位病理学医师阅片诊断后，筛选出符合实验要求的46例样本进行FOXM1和PCNA两种蛋白的免疫组织化学研究。免疫组化基本步骤：样本石蜡包埋后进行连续切片，厚度为2 μm，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱苯，用3%过氧化氢灭活10 min，柠檬酸高压抗原修复3 min，加入一抗（兔抗FOXMI1∶200，鼠抗PCNA：1∶200）4℃ 孵育过夜，复温，加入二抗孵育30 min，DAB显色后经苏木精复染，树胶封片。

1.4 结果判定

1.4.1 FOXM1的判定

食管癌组织样本中FOXM1在细胞质和细胞核都有表达，检测样本中细胞质表达多于细胞核。本实验以细胞胞浆及细胞核出现棕黄色或者棕褐色为阳性，每张切片在200倍镜下随机选取5个视野，采用Image Pro 6.0生物图像软件分析每个视野内阳性细胞平均光密度值。

1.4.2 PCNA的判定

PCNA的阳性表达主要位于细胞核，本实验以细胞核出现棕黄色或者棕褐色颗粒为阳性。由3位病理学实验人员分别对免疫组化切片阳性表达情况进行判定。每张切片在200倍镜下随机选取5个视野，记录每个视野下阳性细胞数以及总细胞数，并计算出平均阳性细胞率。

1.5 统计分析

实验数据以x±s表示，采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。FOXM1在食管癌3组不同部位组织中平均光密度差异，采用配对样本t检验进行组间统计；PCNA的表达差异为阳性百分比，组间统计采用χ2检验对数据进行分析；FOXM1与PCNA样本间表达关系采用线性回归与Pearson检验进行统计学分析。P＜0.05被视为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 FOXM1和PCNA的表达结果

免疫组化结果显示FOXM1主要表达于细胞质中，少部分表达于细胞核，部分质核共表达（图1）。FOXM1在远端正常组织、癌旁组织和食管鳞癌组织中的表达水平逐渐升高，各组之间差异具有统计学意义；PCNA在食管癌组织中主要表达于细胞核中（图2）。结果显示PCNA在食管鳞癌组织中表达最高，癌旁组织中次之，远端正常组织中表达量少。统计学分析显示三组之间PCNA的表达差异具有统计学意义（表1）。

表1 FOXM1和PCNA在食管癌不同部位组织内表达（x±s）

2.2 FOXM1与PCNA表达相关性

线性回归分析显示：FOXM1在癌症组、癌旁组和远端正常组织组与PCNA的表达水平均存在线性关系（R2=0.751，P ＜ 0.01，图3）；Pearson检验结果显示两者之间成正相关（r2=0.748，P＜0.01）。

图1 FOXM1在食管鳞癌组织中的表达(×200)

图2 PCNA在食管鳞癌组织中的表达(×200)

图3 FOXM1和PCNA表达关系

3 讨论

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，在我国食管癌发病率逐年上升，根据最新数据分析预测，2015年食管癌发病率在肿瘤发病排行榜的第3位[3]，生存率低。引起食管细胞病变的诱发因素很多，多基因作用的分子水平的研究尚不成熟，寻找新的治疗靶点就成为食管癌防治工作中的重点。

FOXM1是叉头框转录因子家族的成员之一，作为典型的细胞增生相关的转录因子，参与调节机体内许多重要的生物过程，已经被证实与肿瘤的发生密切相关，在血管生成、迁移、侵袭、上皮间质转化（EMT）、转移、肿瘤巨噬细胞的募集等过程中起到了积极的作用[4]。研究表明，FOXM1在乳腺癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌等肿瘤中均呈现高表达[5-8]，提示FOXM1在肿瘤发生、发展中起着重要作用。本研究证实FOXM1在食管鳞癌组织中具有显著的过表达现象，在癌旁中也有较高表达，而远端正常组织中基本无表达，这提示差异存在的FOXM1与食管鳞癌的病理过程密切相关。Marco等[9]认为食管癌FOXM1的细胞质表达程度与食管鳞癌（ESCC）的病理分期密切相关，细胞核表达则呈现出低年龄化的现象，证实了FOXM1与ESCC的发生发展过程密切相关。

本研究发现食管鳞状上皮细胞的异常增生，包括基底细胞过度增生、间变以及原位癌是食管癌病变早期的主要特征[10]。PCNA是已经被研究证实存在于各种组织的增殖细胞中，参与协调与复制有关的生理过程，其功能相对保守，是稳定的细胞增殖评价因子。研究显示，PCNA在胃黏膜与胃癌细胞中的表达水平与胃癌的发生有关[11-12]。本研究中，PC⁃NA在癌组织中的表达与癌旁组织及远端正常组织存在着极显著差异，与宋姮[13]的研究结果一致。提示食管鳞癌病变过程确实存在上皮细胞的过度增殖的现象，且病变部位的上皮细胞增殖活性更强，细胞的异常增殖可能是食管鳞癌病理变化的主要因素。同时，本研究发现转录因子FOXM1与PCNA在食管鳞癌组织中表达水平呈正相关，也进一步说明高表达FOXM1可能有助于促进肿瘤细胞的异常增殖，但FOXM1与PCNA之间是否存在相互作用还有待于进一步研究。

4 结论

本研究检测了食管鳞癌组织中FOXM1和PCNA的表达水平，发现FOXM1和PCNA在食管鳞癌组织中均呈现高表达，同时发现二者表达水平呈现线性正相关关系，提示FOXM1在食管鳞癌发生过程中起着一定的作用。将来在食管癌中进一步研究FOXM1的功能有助于深入认识FOXM1在食管鳞癌的发生发展中的作用，为进一步解释食管鳞癌的发病机制提供基础。

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