高频超声心动图评价5/6肾切除大鼠心脏结构和功能的变化*

符 珉，龙 静，徐智垚，李宗成，李 磊，成 鑫，邹 平

慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）是一种常见的临床疾病，其发病率高达15%，在CDK发展进程的每一阶段都涉及心血管系统的损害，而且慢性肾功能衰竭病人最终死亡的原因近50%是心血管疾患[1]。心肾综合征（cardiorenal syndrome，CRS）是指心脏和肾脏其中一个器官的急性或慢性功能障碍可能导致另一器官的急性或慢性功能损害的临床综合征。根据其初始器官损害不同和发病机制的不一样，分为5个亚型，其中CRS四型即慢性肾心综合征[2]，是以CDK导致心功能损害、增加罹患心血管意外的风险为特征[3-4]，其机制尚未完全阐明，也缺乏早期诊断的可靠指标。本实验通过5/6肾切除拟建立慢性肾心综合征大鼠动物模型，并用高频超声检测该模型的心功能改变，从而评价高频超声在慢性肾心综合征大鼠动物模型研究中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验动物清洁级雄性SD大鼠24只，体重（250.0±20.0）g，由西南医科大学实验动物中心提供。戊巴比妥钠：进口分装。仪器：使用GE E9彩色多普勒超声诊断仪，所选探头为线阵高频探头12SS-D Cardiac Probe，所用频率为12 MHz（由西南医科大学第一附属医院超声科提供）。

1.2 慢性肾心综合征动物模型的制备

适宜温度及标准饲料喂养，自由进食饮水。大鼠适应性饲养1周后在尾部标注好数字，称重，采用随机数字表法分为2组，各12只，模型组和假手术组。模型组大鼠行5/6肾脏切除手术，按照0.5%戊巴比妥钠1 mL/100g的剂量通过腹腔注射方式麻醉大鼠，然后采取俯卧体位固定于手术台上，局部剪毛、备皮，用碘伏、酒精行常规皮肤消毒，无菌操作下于左肋下脊直肌外侧距左脊肋骨约1.5 cm处行斜向外下方（肾区）做一长约3～4 cm的切口，逐层切开，对肌层行钝性分离，充分暴露左肾，从肾下极向上剥离肾脏包膜但不剪掉（保留肾上腺）；用止血钳夹闭肾脏上下极，待夹闭区域变成紫黑色后，用组织剪剪去左肾上下极约2/3肾组织，注意不要剪到肾窦，迅速用明胶海绵压迫出血区域，逐层缝合关闭腹壁。腹腔内注入庆大霉素，7 d后行第2次手术，采用同样的方法麻醉大鼠并暴露右肾，结扎右肾肾蒂，待肾脏缺血变深色时切除右肾。最终手术共计切除大鼠左右肾脏总和的约5/6。每次术后应保持大鼠呼吸顺畅，禁食1 d，无需禁水，术后3 d密切观察大鼠手术切口及一般情况。假手术组只行相同的麻醉、模拟过程，找到其肾脏但不做肾切除术[5-6]。

1.3 超声心动图检测

各组大鼠于第10周末行胸部剪毛备皮，以0.5%戊巴比妥钠1 mL/100g麻醉，将其仰卧位放置于木板，躯体略左倾（麻醉过程中死亡2只）。超声高频探头置于大鼠胸骨左侧，根据图像显示选择探头旋转角度，以图像效果清晰为准。首先在二维超声模式下显示出大鼠胸骨旁左室长轴切面，左室短轴切面，大动脉短轴切面以及心尖四腔心切面声像图，观察心脏房室大小有无改变，心脏瓣膜及室壁室隔的搏幅运动及回声情况。在左室短轴切面及长轴切面，引出M型曲线，因大鼠心率较快，即使在麻醉状态下也高达300余次，因此为保证图像分辨率，将M型超声扫描速度提高至200 mm/s，待图像稳定后，选着较好处进行测量。测量心脏形态学参数包括:舒张末期的左室后壁及室间隔厚度（LVPWDd、IVS⁃Dd），左室舒张末期和在收缩末期的内径测值（LVEDd、LVESd），收缩期的左室后壁和室间隔厚度测值（LVPWSd、IVSSd）。测量心脏功能的指标：左室射血分数及短轴缩短率（EF、FS）。接着将探头放于心尖，显示心尖四腔心切面，启用TDI模式[7-8]，将取样线置于室间隔与二尖瓣环交界处，尽量使室壁长轴与超声声束方向平行，仍然选择扫描速度为200 mm/s，调整好速度标尺，获得后间隔处二尖瓣环运动频谱，观察各瓣口血流情况。

1.4 肾功能及心、肾组织病理检测

超声心动图检测完成后经腹主动脉采取血样，做血清肌酐、尿素氮检测；采取断颈法处死实验动物，取出心、肾于中性甲醛中固定。HE染色法检测心、肾组织病理变化。

1.5 统计学分析

实验数据采用SPSS18.8统计软件处理分析，以均数±标准差表示，两组比较采用t检验，统计结果以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物的一般状况

第10周末，假手术组大鼠无死亡，一般状况良好，饮食正常，行动灵活，皮毛光滑；模型组大鼠先后死亡3只（不包括做超声心动图检测前麻醉过程中死亡的2只），存活的大鼠表现为进食减少，精神萎靡，皮毛光泽度差，活动度减少。

2.2 各组大鼠的超声心动图检测情况

2.2.1 各组大鼠心脏超声图像比较

各组大鼠均获得较满意的图像效果，大鼠心率很快，高达300余次，左室发达，左室长轴切面见左室腔近似椭圆体，约占据整个画面2/3，右心室较小，紧贴前壁，二尖瓣及主动脉瓣开放关闭自如，心尖四腔清晰，显示四个房室及二、三尖瓣，心尖五腔心切面在心尖四腔心基础上还可显示左室流出道。左室短轴切面显示左室呈圆形，收缩期一致向心性收缩，二尖瓣位于左室中，前后叶呈镜像运动，舒张期呈“鱼口”样张开。二尖瓣瓣口血流频谱为基线以上双峰形，主动脉瓣血流频谱为基线以下单峰形，略似倒三角形，肺动脉瓣血流频谱与主动脉相似。TDI测后间隔处二尖瓣环运动显示为正向单峰负向双峰共三峰的曲线图像。上述超声图像证明大鼠心脏结构与人类相似，但由于大鼠心脏太小且心率过快，难以通过肉眼发现各组形态上的区别（图1）。

图1 各组大鼠心脏超声图像

2.2.2 各组大鼠心脏超声测值比较

模型组与假手术组大鼠心脏超声测值比较，其形态学指标室间隔舒张期厚度（IVSd）、室间隔收缩期厚度（IVSs）均值减少，但P＞0.05，无统计学意义；模型组大鼠心脏左室在舒张末期的内径（LVIDd），与假手术组比较有明显增加（P＜0.05），提示左心室扩大；模型组大鼠心脏在收缩末期的左室内径（LVIDs）和舒张末期的左室后壁厚度（LVPWd）与假手术组比较无显著增加（P＞0.05）。模型组心脏超声功能学指标左室射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）比假手术组均有降低（P＜0.01），提示5/6肾切除后心功能明显降低（表1）。

表1 心脏超声形态与功能学测值比较（x±s，n=6）

2.3 肾功能指标

模型组大鼠血清肌酐和尿素氮测值均较假手术组显著升高（P＜0.01），表明5/6肾切除致慢性肾功能障碍（表2）。

表2 各组的血肌酐、尿素氮测值比较（x±s）

2.4 各组大鼠肾、心组织HE染色结果

HE染色光镜下观察，可见假手术组肾小球分布密集，呈圆形或椭圆形，外周规整，球内毛细血管密集，肾小管的管腔规整。与假手术组比较，模型组大鼠出现大部分肾小球萎缩、纤维化，肾小囊变狭窄其壁增厚，少部分肾小球肥大，部分肾小管管腔不规则、扩张，伴随有肾间质有大量纤维结缔组织增生；同时有较多的染色较深的炎症细胞浸润（图2）。

心室肌组织HE染色后观察切片与假手术组对比，模型组心肌细胞略变粗，排列不均匀，闰节不清晰（图3）。

图2 HE染色各组肾组织形态（×400）

图3 HE染色各组心肌组织形态（×400）

3 讨论

心和肾两个重要器官之间存在非常紧密的联系。临床资料显示，慢性收缩性心力衰竭患者约超过25%会合并慢性肾病，而慢性终末期肾病患者大部分合并心血管疾病且最终死亡于心力衰竭或恶性心律失常等心血管事件[9]。随着医疗水平的不断提高，人均寿命延长，患有心、肾疾病的病人存活率也逐年增加，从而使CRS发生率上升，因而这一临床综合征日益受到广泛的关注，对CRS的早诊断和有效治疗方法的探索是提高病人生存质量的关键。

大鼠5/6肾切除是一种传统的制作慢性肾衰动物模型的方法，随着对心肾综合征概念的广泛认知，探讨心肾之间复杂联系的日益重视，这种方法逐渐被应用于慢性肾衰所致心脏改变的实验研究中。本实验采用大鼠5/6肾切除法复制慢性肾心综合征动物模型，结果显示模型组大鼠经5/6肾切除10周后，一般状况较差，血清肌苷、尿素氮显著增高，其血清肌苷水平平均达146.25 μmol/L；肾血管壁增厚，管腔变小，肾小球系膜基质增多；有较多的炎症细胞浸润，肾小管明显扩张、肾小球有大部分萎缩。模型组心肌细胞变粗，排列不均匀，闰节不清晰。在CDK发展进程中，RASS的激活，以及随着压力负荷及容量负荷增加、继发性甲状旁腺功能亢进、磷钙代谢异常、尿毒症毒素直接毒性作用，贫血、血管内皮功能减退、全身微炎症环境及FGF23与TGF等信号转导分子的复杂作用，都会导致心肌组织的损害，从而出现心脏结构与功能改变。

近年来观察大鼠心脏结构、功能的方法不断完善，如经食道超声心动图测定心功能[10]等，而经胸高频超声心动图可测定心功能，还可以观察大鼠心脏结构，而且是无创检查。超声频率越高，近场图像越清晰，分瓣率越高。大鼠心脏体积小，皮下深度浅，常规3.5 MHz心脏探头无法分辨其结构，而频率为12 MHz的高频探头在常规心脏超声切面上（如胸骨旁左室长轴、左室短轴、大动脉短轴切面及心尖四腔心等）可以清晰显示大鼠心脏结构和各瓣口血流频谱形态[11]。据大量文献报道高频超声测定的大鼠心脏指标与尸解所测得的数据高度相关[12]。因为大鼠心脏过小，如果直接在二维图像上测量，误差较大，所以常选择M型曲线测量，但由于大鼠心率很快，达300～490次/min，即使在麻醉状态下也达到200次/min以上，而常规的M型曲线扫描速度过低，二尖瓣前向血流E峰与A峰融合，难以满意显示大鼠左心室波群，因此本组实验M型扫描将速度提高至200 mm/s，可以获得较清晰的图像，为房室大小、室壁厚度及左心室功能的准确测量提供了保证。本实验检测结果显示，室间隔舒张期厚度（IVSd）、室间隔收缩期厚度（IVSs）、左室后壁舒张末期厚度（LVPWd）和左室收缩末期内径（LVTDs）无明显变化。据张晓芳[13]的报道，持续17周后，模型组大鼠左室舒张末期后壁厚度（LVPWd）、左室舒张末期前壁厚度（LVAWd）和校正后的左室质量（LV Mass）有明显增加（P＜0.05或P＜0.01）。本实验仅持续10周时间，因此随着时间的延长，存活大鼠的心脏结构改变更为显著。但本实验中模型组大鼠的左室舒张末期内径（LVIDd）已有显著增加，左室射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）显著降低。总之，高频超声心动图可以较准确地诊断大鼠心脏结构功能的变化，但大鼠前胸壁隆起，且心脏体积小，探头放置易不稳，因此对检查人员的操作水平要求较高，只有操作熟练，手法稳当，且能熟练调试仪器的人员才能获得清晰的图像。

4 结 论

本实验通过5/6肾切除，成功建立了慢性肾心综合征大鼠模型；经胸高频超声心动图可以较好地显示大鼠心脏，得到满意的超声心动图，且安全无创，能较好地评价慢性肾心综合征大鼠心脏结构和功能的变化，可供基础与临床研究借鉴。

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