低鱼粉饲料中补充蛋氨酸、胆汁酸、牛磺酸对中华绒螯蟹幼蟹生长、饲料利用及抗氧化能力的影响

陈 晴，马倩倩，沈振华，李二超，陈立侨

（华东师范大学生命科学学院，上海 200241）

鱼粉作为水产饲料中至关重要的蛋白源，具有蛋白含量高、氨基酸平衡等优点。近年来全球范围内养殖业对鱼粉的需求量不断提高，其价格随之升高，以适当的植物蛋白源替代鱼粉已经成为水生动物营养研究学者们关注的重要课题［1-3］。植物蛋白源来源广泛，价格相对较低，但存在多种不同抗营养因子，且某些必需氨基酸比例失衡，数量偏低［4］，替代比例过高会导致饲料适口性差、消化率和蛋白质效率的下降，影响水生动物的摄食和生长［5-7］，降低产品的质量。为了提高植物蛋白源替代鱼粉的效率，往往需要额外添加必需氨基酸和（或）其它有效成分，如胆汁酸、牛磺酸等来提高对植物蛋白源饲料的利用率。

蛋氨酸是水生动物生长和发育所必需的含硫氨基酸，它直接参与蛋白质的合成，作为主要甲基供体参与DNA和蛋白质的甲基化作用，以及其它生理活性物质合成的前体物质。水产饲料中的植物蛋白源普遍缺少蛋氨酸［8-10］，过量的植物蛋白会引起动物食欲下降，生长减慢。有研究表明，饲料中蛋氨酸明显缺乏时，会引起奥尼罗非鱼（Oreochromis niloticus）［11］体蛋白合成率下降，随蛋氨酸水平的提高，体蛋白合成率则随之增高；有学者发现合理补充蛋氨酸可以提高大黄鱼 （Pseudosciaena crocea）［12］、日 本 囊 对 虾（Marsupenaeus japonicus）［4］的生长率和肌肉的比例［13］。

牛磺酸是一种含硫氨基酸，具有广泛的生物学效应，参与多种机体正常生理功能的调节［14-16］，但几乎所有植物蛋白源都缺乏牛磺酸［3］［17］。牛磺酸在维持高等动物的中枢神经系统和细胞膜稳态、结合胆汁酸、繁殖和免疫功能等方面均有重要作用［18-20］。不同种类鱼合成牛磺酸的能力有所不同［21］，其中肉食性鱼类自身合成牛磺酸的能力是较差的，如果饲料中也缺乏牛磺酸，机体会表现出生长不良等症状，而在牛磺酸得到合理补充之后鱼类的生长性能可得到改善［22］。

胆汁酸是一种存在于胆汁中的类固醇酸，是胆汁的重要组成成分，能促进脂肪吸收和蛋白质消化利用，同时还具有一定的杀菌作用。有研究表明胆汁酸能够促进大菱鲆（Scophthalmus maximus）［23］和鲤（Cyprinus flammans）［24］等鱼类的生长。由于虾、蟹类没有胆囊，机体无法分泌胆汁和形成胆汁酸，虽有初步实验表明适量的胆汁酸制剂对罗氏沼虾（Macrobrachiumro senbergii）具有促生长作用［25］，但迄今该方面尚没有较为完整和深入的报道。

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）在我国的淡水渔业中占有重要的地位。有研究表明，其配合饲料中过度使用植物蛋白替代鱼粉会引起氨基酸比例失衡，缺乏促生长因子，导致饲料适口性差，摄食和生长下降等问题［17，26-27］，但尚未见在高比例植物蛋白饲料中补充生理活性物质以提高饲料营养价值的报道。本研究以40%的棉粕为主要蛋白源，探讨了外源补充蛋氨酸、胆汁酸和牛磺酸对幼蟹生长和生理指标的影响，以期为提高植物蛋白源的利用率，完善中华绒螯蟹的人工饲料配方提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验饲料

本实验以棉粕为主（棉粕占40%）的植物蛋白和15%鱼粉为蛋白源、鱼油和豆油（1∶1）为脂肪源配制低鱼粉基础饲料（表1）。根据有关文献，在低鱼粉基础饲料中分别添加0.5%蛋氨酸（Met），0.5%、1.0%胆汁酸（Bile），0.5%、1.0%牛磺酸（Taurine）作为实验饲料为5个试验处理组，并以基础饲料中不使用添加剂的低鱼粉组（鱼粉占15%，记为LFM）和全鱼粉组（鱼粉占64.4%，记为FM）为对照，按等氮等能的原则配制成共7组饲料。原料经粉碎过80目筛，经准确称重后按照逐级放大的原则混匀，加入油源和适量的水混合均匀，用F-26双螺杆挤条机（华东理工大学科技实业总厂，中国）加工成直径1 mm的颗粒，室温风干至水分小于10%时，保存在-20℃冰箱中备用。实验饲料配方见表1。

1.2 实验动物驯化、分组与管理

实验用幼蟹采购自上海崇明养殖场。幼蟹经过一周的暂养，随机挑取规格相似，平均体重（0.26±0.02）g的个体用于实验。实验一共设置7个组（分别为2组对照和5组试验处理组），每组5个重复，将选取的幼蟹随机放入水族箱（规格为80 cm×60 cm×60 cm），每个重复30 ind蟹。每个水族箱中放置数片拱形瓦片为幼蟹提供栖息藏匿。养殖期间，进行饱食投喂，每天上午8∶00和下午16∶30投喂2次，投喂前收集粪便，投喂2 h后回收残饵。每天统计脱壳数和死亡情况，及时将死蟹取出并称重。补充经充分曝气处理的养殖用水，每日换水1／3～1／2，养殖期间不间断充气，实验期间水温为24.0～29.0℃，溶解氧 ＞7.0mg·L-1，总氮 ＜0.01 mg·L-1，pH为8.0±0.4，养殖周期为8周。

1.3 样品收集和分析

养殖实验结束时，禁食24 h后对每个水族箱的幼蟹称重，然后统计幼蟹的存活数量。每个水族箱随机选取5 ind蟹保存于-20℃冰箱，以用于体成分分析。剩余的蟹置于冰上麻醉后，用1 mL不含抗凝剂的注射器从第三足基部取血淋巴，4℃静置过夜，5 000 r·min-1离心10 min后取血清保存于-80℃待测。取血后的蟹解剖取肝胰腺和肠道，保存在-80℃备用。

表1 饲料配方组成及营养成分Tab.1 Composition and nutrient content of experimental diets

1.3.1 体成分及饲料营养成分和能量分析

全蟹及饲料的常规体组生化成分的分析，参考AOAC［28］的标准方法。水分测定采用105℃烘干至恒重法（24 h），粗蛋白含量测定采用凯氏定氮法（FOSS，Kjeltec2200，Denmark），粗脂肪测定采用索氏抽提法（FOSS，SoxtecTM 2043，Denmark），灰分测定采用马弗炉灼烧法（550℃，14 h）。

饲料总能采用WELL9000型全自动快速量热仪（上海欧锐仪器设备有限公司）进行测定。

1.3.2 抗氧化酶活性和丙二醛含量的测定

粗酶液的制备：准确称取肝胰腺或肠道，记重，按质量体积比1∶9加入预冷磷酸缓冲液（PBS，pH 7.0，1.0 mol·L-1）制成 10%匀浆液，2 500 r·min-1离心10 min，取上清液待测。

超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。

超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定是采用黄嘌呤氧化酶法（羟胺法）测定。按照肝胰腺酶液的每毫升反应液中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量记作一个SOD活力单位（U·mg-1）。过氧化氢酶（Catalase，CAT）的测定采用Pinho的过氧化氢法，其中：在温度30℃、pH 8.0的条件下，每毫克蛋白每分钟分解1 mol底物过氧化氢所需要的酶量记作1个酶活力单位（U·mg-1）。

丙二醛含量的测定采用TBA法，其原理是过氧化脂质降解产物中的丙二醛（MDA）可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰，从而推算MDA的量。蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法［29］。

1.3.3 肝胰腺和肠道的淀粉酶，脂肪酶和总蛋白酶的测定

淀粉酶（AMS）以可溶性淀粉为底物，采用碘-淀粉法，在660 nm波长下测吸光度。酶活力单位定义：100 mL酶液中的淀粉酶，在37℃、15 min水解5 mg淀粉为1个酶活力单位［30］。

脂肪酶（Lipase）和总蛋白酶（total protease）采用ELISA试剂盒（上海恒远生物科技有限公司）测定。

1.4 计算方法

生长指标计算公式如下

存活率（Survival rate，%）＝［（N0—Nt）／N0］×100%

增重率（Weight gain rate，%）＝［（Wt—W0）／W0］×100%

特定生长率（Specific growth rate，%／d）＝［（Ln Wt—Ln W0）／d］×100%

饲料系数（Feed conversion ratio）＝IF／W

蛋白质效率（Protein efficiency）＝W／IN

其中，N0和Nt分别为实验开始和结束时蟹的个数；Wo和Wt分别为幼蟹初始和终末重量（g）；W为蟹体总增重（g）；IF为实验期间总摄食饲料干重（g）；IN为实验期间总摄食饲料蛋白质质量（g）；d为实验天数（56 d）。

1.5 数据分析

实验数据均以平均值±标准误（Mean±SE）表示，先用SPSS 19.0进行单因素方差（One-way ANOVA），若存在显著差异（P＜0.05），则采用Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 生长性能

从表2可见，各个组幼蟹的存活率均无显著性差异（P＞0.05）。FM组和0.5%Met组的增重率及特定生长率最高，显著高于LFM组和其它各试验组。而LFM组的饲料系数则显著高于FM和其它各试验组。FM组、0.5%Met组的蛋白质效率显著高于LFM组，但与1.0%Bile组、0.5%Tau组和1.0%Tau组无显著性差异。

2.2 全蟹体成分

全蟹体成分各个组的水分、粗蛋白、灰分均无显著性差异（表3）；0.5%Met组的粗脂肪含量最高，与 FM组、0.5%Bile组、0.5%Tau组均无显著性差异，LFM组、1.0%Bile组和 1.0%Tau组的粗脂肪含量较低。

2.3 消化酶活力

肝胰腺消化酶LFM组的淀粉酶活性最高，显著高于FM组和其它各试验组（表4）；与之相对应的是，FM组的总蛋白酶最高，显著高于其它各试验组，与LFM组相比，0.5%Bile组的总蛋白酶显著提高；0.5%Met组的脂肪酶活性最高，显著高于其它组。

LFM组的肠道淀粉酶活性最高，显著高于其它各组，相比之下，FM组和0.5%Met组的淀粉酶活性最低；FM组和0.5%Met组的肠总蛋白酶最高，显著高于其它各组，0.5%Bile组次之，LFM组最低，与LFM组相比，0.5%Tau组有显著的提高；0.5%Met组的脂肪酶活性最高，显著高于其它各组，而LFM组的脂肪酶活性最低。

表2 补充蛋氨酸、胆汁酸和牛磺酸对幼蟹生长率和饲料利用率的影响Tab.2 G row th performance，feed utilization of E.sinensis fed w ith different experim ental diets for 8 weeks

表3 补充蛋氨酸、胆汁酸和牛磺酸对幼蟹全蟹体成分的影响Tab.3 W hole body proximate com position（%）of E.sinensis fed w ith different experimental diets for 8 weeks（%）

2.4 抗氧化能力

幼蟹肝胰腺抗氧化指标，LFM组的丙二醛（MDA）含量最高，显著高于其它各组（表5），而FM组的丙二醛含量最低；相应地，FM组的超氧化物歧化酶（SOD）活性最高，与0.5%Met组无显著性差异，该两组均显著高于其它各组，其中LFM组活性最低；FM组的过氧化氢酶（CAT）活性最高，LFM组最低，与LFM组相比，0.5%Met组、添加Bile和Tau的处理组过氧化氢酶活性均显著性提高。

表4 补充蛋氨酸、胆汁酸、牛磺酸对幼蟹肝胰腺及肠道消化酶活力的影响Tab.4 Specific activity of am ylase，lipase and total protease in hepatopancreas and intestines of E.sinensis fed w ith different experimental diets for 8 weeks

表5 补充蛋氨酸、胆汁酸、牛磺酸对幼蟹肝胰腺的SOD、CAT活性和MDA含量的影响Tab.5 Specific activity of superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT）and malondialdehyde（MDA）content in hepatopancreas of E.sinensis fed w ith different experim ental diets for 8 weeks

3 讨论

3.1 补充蛋氨酸、胆汁酸和牛磺酸对幼蟹生长和体成分的影响

本研究发现，在利用高比例植物蛋白替代鱼粉的饲料中补充适当蛋氨酸后，显著提高了幼蟹的生长率，表明蛋氨酸］能补充饲料中缺乏的必需氨基酸［12］，为机体的蛋白质合成及含硫化合物的代谢提供了物质基础。本研究结果与之前学者对鲤、印度鲤幼鱼和尼罗罗非鱼的相关实验结果相似，即外源补充蛋氨酸可以显著提高以上鱼类的摄食率和生长性能［31-33］。

有学者发现添加胆汁酸能显著提高罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）的增重率和成活率［25］，但与日本囊对虾（Seriolaquinquera diata）的研究相似，外源添加胆汁酸未能表现出明显促进机体生长的效果［34］。从实验结果来看，补充胆汁酸虽未能显著提高幼蟹的增重率，但可以显著提高饲料效率。类似地，有研究表明饲料中添加胆汁酸能够有效提高牛蛙（Rana Catesbelana）饲料效率［35］，还有学者发现胆汁酸可以刺激大马哈鱼（Oncorhynchus keta）的嗅觉，起到诱食剂的作用［36］，本实验也观察到添加胆汁酸能促进幼蟹的摄食，为胆汁酸可以刺激动物的嗅觉系统而促进摄食提供了依据［37-38］。

外源补充牛磺酸未能有效改善幼蟹的增重率和蛋白质效率，原因可能与饲料中鱼粉含量偏低而导致一些主要限制性氨基酸（如蛋氨酸、赖氨酸等）不足有关，提示在必需氨基酸受限的情况下，补充牛磺酸不能有效促进机体的蛋白质合成代谢、提高生长率［39］。类似地，饲料中添加0.2%和0.45%以上的牛磺酸，均未能有效提高军曹鱼（Rachycentron canadum）和黑鲈（Lates calcarifer）的增重率［40-41］；邱小琮等［42］研究则表明，当饲料中牛磺酸添加量过高（1 800 mg·kg-1）时，草鱼的生长受到了抑制。由此可见，饲料中氨基酸受限时，牛磺酸不能替代机体蛋白质合成所需的必需氨基酸发挥作用。牛磺酸作为条件必需氨基酸，其生理活性的发挥与基础饲料中氨基酸数量和质量之间的关系，尚需进一步深入研究。

与全鱼粉组相比较，低鱼粉组的全蟹粗脂肪含量明显降低，而补充蛋氨酸组则有明显提高。补充0.5%胆汁酸组和0.5%牛磺酸后，全蟹粗蛋白和粗脂均没有受到显著的影响，这与对银鳕（Anoplopoma fimbria）［3］的研究所得到的结果相类似。当胆汁酸和牛磺酸的添加量增到1.0%时，全蟹粗脂肪含量有所下降，可能原因是胆汁酸和牛磺酸具有降脂作用，其中牛磺酸还具有促进脂肪酸氧化和减少脂肪合成的作用［43］。如何在饲料中补充适宜的胆汁酸、牛磺酸，以提高中华绒螯蟹对脂肪的利用效率和节约蛋白，值得进一步探讨。

3.2 补充蛋氨酸、胆汁酸和牛磺酸对幼蟹消化酶的影响

甲壳动物的消化酶活性也受饲料营养素的影响，当机体摄入足够的氨基酸时，消化腺能够更顺利合成消化酶［44］，本研究发现，外源补充蛋氨酸显著提高了幼蟹肝胰腺和肠道总蛋白酶和脂肪酶的活性，但当饲料中限制性氨基酸含量不足时，则会影响机体的蛋白质合成，本研究中添加胆汁酸组未能有效提高幼蟹消化酶活力的结果可得到初步的验证。有研究表明蟹胃液中没有分离提纯得到胆汁酸和胆汁醇，其具有表面张力和乳化能力的复合物质由脂肪酸、牛磺酸和肌氨酸组成［45］。迄今尚没有证据表明中华绒螯蟹固有的消化途径可不经过胆汁酸参与，然而胆汁酸的化学构型上具有亲水和疏水的两个方面，这样的结构特点使胆汁酸具有较强的界面活性，能够降低油／水两相间的表面张力，促进脂类乳化。外源补充的胆汁酸是否参与了乳化脂肪及促进脂肪的乳化、吸收利用还不清楚。

从本实验结果来看，补充牛磺酸后，幼蟹肠道脂肪酶活性显著增高。对黄河鲤（Cyprinus carpio）［46］和鲷（Pagrusmajor）［3］的研究也发现，牛磺酸能够激活脂肪酶活性。说明牛磺酸能够参与脂肪吸收利用的过程，但关于虾、蟹类牛磺酸的代谢过程知之甚少，尚无相关的详细报道。

3 .3 补充蛋氨酸、胆汁酸和牛磺酸对幼蟹抗氧化能力的影响

在本实验中，补充蛋氨酸实验组幼蟹的丙二醛含量低于低鱼粉组，SOD活性和CAT活性则显著高于低鱼粉组，提示补充适量蛋氨酸可以提高幼蟹的抗氧化能力，这与对鲤［47］的研究结果是一致的，可能是因为机体内蛋氨酸代谢生成的半胱氨酸，它继而参与抗氧化物质还原型谷胱甘肽的合成，恰恰还原型谷胱甘肽是细胞内主要的溶解性抗氧化剂，从而增强了机体抗氧化能力。

实验还发现，胆汁酸的添加提高了幼蟹的抗氧化能力，有可能是通过提高肝细胞内谷胱甘肽和巯基蛋白水平，保护肝细胞，避免其受活性氧的损伤［48］。类似地，有学者发现在饲料中添加胆汁酸能够提高草鱼（Ctenopharyngodon idellus）血清的超氧化物歧化酶（SOD）的活性，机体的抗氧化能力得到显著提高［49］。

牛磺酸（及其衍生物）具有清除机体活性氧及其它氧化性有害物的功能。在本实验和有关学者对鲤的研究中［50］均得到了验证，本实验在饲料中添加牛磺酸后，鲤血清中的MDA含量明显地降低、SOD活力和CAT活力随着饲料中牛磺酸添加量提高而升高，添加0.10%时效果最好，超过该添加量时抗氧化酶的活力反而下降，提示牛磺酸可能具有条件毒性，对于不同物种有一定的适宜添加范围。

4 小结

在高比例植物蛋白的低鱼粉饲料中适量补充外源蛋氨酸，可以明显改善饲料适口性，有效提高幼蟹对饲料的摄食和利用率，促进幼蟹的生长；补充牛磺酸和胆汁酸未能有效改善幼蟹的生长，考虑到牛磺酸作为条件必需氨基酸所能发挥的促生长效应与胆汁酸的蛋白质节约效应，都与饲料中的限制性氨基酸含量密切相关，本研究提示，为了有效发挥牛磺酸和胆汁酸的饲料添加功效，应注意在饲料中补充适宜比例和数量的限制性氨基酸，合理控制植物蛋白替代鱼粉的比例，或通过补充限制性氨基酸，来提高机体的生长和饲料利用效率。

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