基于形态测量和DNA条形码的中国鲻科鱼类分类研究

黄镇宇，章 群，卢丽锋，周 琪，唐楚林

（暨南大学生态学系，广州 510632）

鲻科（Mugilidae）鱼类隶属硬骨鱼纲（Osteichthyes）鲻形目（Mugiliformes），广泛分布于热带亚热带及温带海洋［1］，不仅影响着邻近海域生态系统的营养转移和浮游生物的丰富度，具有重要的生态意义［2-3］，同时具有生长速率快、产量高、肉味鲜甜等特点，是世界重要的经济鱼类［4-5］。但近年来，受过度捕捞和环境污染等影响，中国近海范围内的鲻科鱼类资源已锐减，处于被过度利用的状态［6-7］，亟待开展种质资源的保护及开发利用的研究。

正确鉴定物种是开展生态调查与资源管理的前提。传统的形态分类方法易受鉴定者的主观经验、样本的保存状况、发育阶段及其环境因素的影响而出现鉴定错误。为避免主观因素的影响，BEDDOW等［8］提出形态测量方法，即将在鱼类样本上标出一系列坐标点间的间距作为不同的形态参数，通过统计学方法比较不同鱼类间形态的相似性与差异性进行物种的分类，但该方法无法完全区分形态相似的物种。为此，HEBERT等［9-10］提出了 DNA条形码的概念，即通过分析一段标准的目标基因DNA序列对物种进行鉴定。在DNA条形码对鸟类、鱼类和昆虫等生物的鉴定成功［9-10］之后，线粒体 CO I序列5’端处约650 bp长度的序列分析凭借DNA的提取方便、种间与种内距离具有明显间隔等特点，在揭示隐存种、鉴定缺少形态变化或标本残缺的物种等方面具有突出优势，逐渐成为动物界首选DNA条形码标记［11-12］。

鲻科鱼类外部形态保守（尤其在幼鱼阶段），有效的种间划分特征不明显［13］，迄今分类存在争议，如NELSON［14］将世界鲻科鱼类分为17属72种，THOMSON［15］则认为是 14属 62种。中国鲻科鱼类曾被划分为5属28种，后更改为7属13种［16］。目前，形态测量方法和DNA条形码技术已被运用在鲻科鱼类的研究中。如刘建勇［5］通过形态计测比较了国内鲻科鱼类的不同地理群体的异同；刘璐等［17］测定了国内5省9个地点5种鲻科鱼类25个样本的DNA条形码序列；上述研究解决了中国部分鲻科鱼类的分类问题，但涉及地区和种类有限。本研究测量了中国8省27个地点的7种鲻科鱼类226个样本的40项形态数据，并进行了形态聚类分析、主成分分析、判别函数分析，同时还测定了其中57个样本的CO I基因5’端的部分序列，并结合从Genebank数据库下载的关于中国鲻科鱼类的9种鱼27条同源序列，开展中国鲻科鱼类的DNA条形码研究，旨在丰富中国鲻科鱼类的DNA条形码数据库，为中国鲻科鱼类种质资源的管理保护与开发利用提供参考依据。

图1 鲻科鱼类的框架结构图（参照BEDDOW等［8］修改）Fig.1 M orphometricmeasurements of Mugilidae（revised based on BEDDOW et al［8］）

1 材料与方法

1.1 物种鉴定、形态测量和统计分析

结合《南海鱼类志》［18］与《中国鱼类系统检索》［19］，鉴定本实验室保存的鲻科鱼类标本，参照BEDDOW等［8］的方法和12个解剖学坐标点对采自中国8省27个地点的鮻（Liza haematocheila）49 ind、棱鮻 （Liza affinis）50 ind、圆吻凡鲻（Valamugil seheli）60 ind、灰 鳍 鮻 （Liza melinopterus）1 ind、鲻（Mugil cephalus）11 ind、绿背鮻（Liza subviridis）52 ind、未命名种 B（Liza sp.B）3 ind共226个样本进行40项数据的测量，分别如图 1所示：1（全长）、2（标准长）、3（头长）、4（头高）、5（吻长）、6（眼径）、7（尾柄长）、8（尾柄高）、9（背鳍高）、10（胸鳍长）、11（腹鳍长）、12（臀鳍基长）、13（臀鳍长）、14（眼间距）、AB、AC、BC、BD、BE、CD、CE、DE、DF、DH、EF、EG、EH、FG、FH、GI、GH、GJ、HJ、HI、IJ、IK、IL、JK、JL、LK。然后将测得数据（除全长外）全部除以全长，转换成百分比，最后通过SPSS软件输出形态聚类图、主成分分析图、判别函数图。

1.2 分子实验与数据处理

参考乐小亮等［20］方法提取鱼类样本的DNA，使 用 扩 增 引 物 FishF2_t1：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAG ATATCGGCAC［21］， FR1d_t1： 5’-CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGAARA AYCARAA［22］，以及本实验室自行设计的引物COIF：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCCTGTGGC AATYACDCGCTGAT，COIR：5’-CAGGAAACAG CTATGACNACYTCNGGRTGNCCRAAGAA进行PCR扩增，经凝胶电泳后将条带清晰明亮的PCR产物送于华大基因公司，使用引物 5’-TGTAAAA-CGACGGCCAGT［23］进 行 测 序。 从GenBank下载中国鲻科鱼类同源序列，通过MEGA［24］等软件对测得的序列进行人工校对及碱基构成、颠换率的计算，并构建基于K2P模型的系统邻接树和计算分支间、分支内遗传距离，运用ABGD（automatic barcode gap discovery）方法进行假设种的分析［25］。本文所分析的序列详情见表1。

表1 中国鲻科鱼类采集地点、数量、编号与序列来源Tab.1 Sampling locations，sample sizes，codes and sequence origins of M ugilidae from Chinese waters

2 结果与分析

2.1 鲻科鱼类量度特征的分析

在形态聚类图上（图2），首先聚类的是圆吻凡鲻、鲻和棱鮻，然后绿背鮻、Liza sp.B、鮻、灰鳍鮻依次加入聚类。在主成分散点图上（图3），棱鮻和鲻与其它种类在第一主成分（躯干特征）中的重叠部分较少；在第二成分（头部特征）中，各种鱼重叠部分较多，不能较好区分开来。判别函数分析结果表明（图3），棱鮻的判别率是最高的，达到100%；绿背鮻的判别率最低，只有87.5%。在预测组中的32例中，1例被误判为鮻，1例被误判为鲻，2例被误判为棱鮻；鮻的判别率为94%，在预测组中的50例，有3例被误判为鲻；鲻的判别率为96.7%，在预测组的30例中，有一例被误判为鮻；圆吻凡鲻的判别率为96.7%，在预测组的60例中，一例被误判为绿背鮻，一例被误判为棱鮻。此外，因灰鳍鮻及Liza sp.B的样本数量不够，无法进行主成分、判别函数分析。

2.2 鲻科鱼类DNA条形码分析

在652 bp序列中，共发现多态位点221个，简约信息位点215个，没有出现碱基的插入或缺失。A、T、C、G平均含量为：23.3%、29.9%、28.5%、18.3%，其中 A+T含量（53.2%）大于 C+G含量（46.8%），与其它硬骨鱼类CO I序列碱基组成的基本特征一致。转换与颠换比4.46，表明序列突变没有达到饱和，适合于系统发育分析［26］。

图2 形态量度的聚类图Fig.2 Dendrogram of M ugilidae constructed by morphometric measurements

图3 5种鲻科鱼类40个测量特征的主成分散点图（左）与判别函数得分（右）Fig.3 Scatterplot of principal component analysis（left）and discrim inant scores（right）based on 40 morphologicalmeasurements of 5 species of Mugilidae

在邻接树上14种鱼类84条序列形成了12个明显的分支（图 4），分支间平均遗传距离17.14%（7.26% ～23.94%）约为分支内平均遗传距离 0.24%（0～1.5%）的 71倍（图 5），与ABGD分析结果相符（图6）：当先验遗传距离大于2.15%时，鲻科被分成12个假设种。其中，Liza sp.A、鮻、大鳞鮻、绿背鮻、黄鲻、粒唇鲻、鲻、帕氏凡鲻独立成支，分别对应分支 2、3、5、7、8、9、10、11。从Genbank下载的灰鳍鮻序列LizamelY.LeiZ1与实验测序的棱鮻序列聚合在分支1上，其余的灰鳍鮻序列在分支4；下载的Liza sp.C与实验测序的Liza sp.B序列混杂在分支6中；下载的长鳍莫鲻序列和测序的圆吻凡鲻序列混杂在分支12。鲻进一步分成2个单系分支，分支间平均遗传距离2.44%约为分支内平均遗传距离0.08%的31倍，与ABGD分析结果一致（图5）：当先验遗传距离为0.28% ～2.15%时，鲻科被分成了13个假设种。

图4 基于K 2P模型的进化树Fig.4 NJ trees based on K 2Pmodel

3 讨论

3.1 鲻科鱼类的种间形态特征

在形态聚类图中，大鳞鮻、棱鮻和鲻首先聚类，表明3者形态较为接近；鮻、灰鳍鮻最后加入聚类，表明与其它鱼有较大形态差异。在主成分散点图中，棱鮻和鲻与其它种类在第一主成分（躯干特征）上的重叠部分较少，各种鱼在第二成分（头部特征）上重叠部分较多；表明棱鮻和鲻在躯干特征上与其它鱼类差异最大。据判别函数分析，棱鮻的判别率最高，表明最容易辨认；绿背鮻的判别率最低，表明易被误判为其它物种；但这一结论不完全符合形态聚类分析结果，表明根据形态测量进行的分类结果可能会随着分析的方法不同而有所不同。总体而言，鮻、圆吻凡鲻、绿背鮻、鲻、棱鮻等5种鱼在主成分散点图及判别函数散点图（图2、图3）上都出现了较高程度的重叠，说明种间的区别不明显，不能完全依靠单一的量度特征进行分类鉴定。

3.2 根据DNA条形码推测鲻科鱼类的分类地位

利用基于CO I基因序列的DNA条形码进行物种鉴定有2个主要标准［9-10］：1）种间遗传距离接近或大于种内遗传距离10倍。2）种内遗传距离一般不大于2%。鲻科鱼类邻接树上的12个分支的分支间平均遗传距离17.14%（7.26%～23.94%）约为分支内平均遗传距离0.24%（0～1.5%）的71倍，其中8种物种独立成支，支持其物种有效性。对于混杂分支的鱼类而言，因无法对从Genbank数据库下载的序列进行形态鉴定，在此仅对其分类地位的可能性作以下推测：1）鉴定有误。由于鱼类的种间外观形态相似，个体形态随着发育阶段的不同而改变［27-28］，故根据传统分类学进行分类时容易出现鉴定错误。下载的灰鳍鮻序列LizamelY.LeiZ1与实验测定的棱鮻序列聚合在分支1上，其余的灰鳍鮻序列占据了分支4，而分支1的分支内遗传距离0.2%远少于HEBERT等［9-10］提出的种内遗传距离为2%的阈值，表明下载的灰鳍鮻序列LizamelY.LeiZ1可能隶属棱鮻。2）Liza sp.B与Liza sp.C是同一物种。因2者聚集的分支的分支内遗传距离为0，属种内差异［9-10］。3）圆吻凡鲻及长鳍莫鲻为同种异名。由于鲻科鱼类种类繁多且种间的形态相似，其鉴定结果中存在不少同种异名，仅鲻就出现过至少33个同种异名［29］。由Genbank下载的长鳍莫鲻序列和实验室测定的圆吻凡鲻的序列混杂在分支12，其分支内遗传距离为0.2%，属种内水平［9-10］，故推测它们可能是同种异名。4）杂交所致。当种间的生殖隔离机制薄弱时容易出现杂交情况［30］，杂交所产生的后代可能会偏向其中一种亲本的形态，而线粒体为母系遗传，以致其分子与形态的鉴定结果不一致，造成邻接树上的分支出现不同物种的混杂。如CASTRO等［31］研究中就曾推测鲻科鱼类因杂交而导致邻接树的混杂。杂交现象的确认需结合更充足的样本和核基因分析。

图5 分支间（左）与分支内（右）遗传距离的柱状图Fig.5 The histogram of genetic distance between（left）and among（right）clades

图6 鲻科鱼类ABGD分析Fig.6 Automatic barcode gap discovery analyses of M ugilidae

鲻2个分支间的遗传距离2.44%，约为分支内平均遗传距离0.08%的31倍，满足HEBERT等［9-10］提出的10×法则，或可认为是不同的物种。但因其分支间的遗传距离接近 HEBERT等［9-10］提出的种内阈值2%，且2个分支对应的样本的外部形态较为相似，故其可能仍隶属同一物种。据宫亚运等［32］对棱鳀属（Thryssa）鱼类和BUTLIN等［33］对 Chorthippus parallelus的研究，在分子上有较高的亲缘关系且在形态上有局部差异的不同群体可能是同一物种的不同亚种，而本项研究中的鲻2个分支存在类似情况，二者分别对应尾鳍长较长、体高较短，与尾鳍较短、体高较长等2组形态，或可作为鲻的2个亚种。由于物种的进化是连续的，种内与种间的差异并没有绝对的标准［34］，故鲻2个分支的准确分类地位需进一步研究。

4 展望

形态测量结果表明，鲻科鱼类的外部形态较为相似，仅依据传统的形态分类方法进行鉴定会容易出现错误。结合形态测量及基于线粒体CO I基因5’端序列的DNA条形码进行分类，因统计学的客观性与分子上种间与种内间隔明显等特点，可提高鲻科物种鉴定结果的准确性。正如我们在前期工作中，由于样本的保存问题和传统经验不足等因素，曾将Liza sp.B与绿背鮻混淆，后通过形态测量及DNA条形码分析则可准确区分。

由于线粒体是母系遗传，不能完全反应双亲的遗传信息，对于混杂成支的鱼类中存在杂交情况的推测，需结合核基因进一步验证。另外，本研究仅涉及中国鲻科鱼类的部分属种，且灰鳍鮻、Liza sp.B及鲻的样本数量不足，无法进行主成分、判别等分析，需在日后的采样工作中补充物种及样本数量，以进一步明确中国鲻科鱼类的分类地位，为种质资源的管理与开发利用提供科学依据。

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