银鲳染色体核型研究

周剑光，张 林，张晨捷，张 涛，彭士明

1.农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心，中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223；2.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090）

银鲳（Pampus argenteus）俗称“镜鱼”，隶属于硬骨鱼纲（Osteichthyes），鲈形目（Perciformes），鲳亚目 （Stromateoidei），鲳 科 （Stromateidae）、鲳属［1］，分布于印度洋、西太平洋，从波斯湾到印尼等海域。为中国近海的常见鱼类，东海、南海与黄渤海较多［2-3］。喜欢在浅海岩礁、沙滩水深10～20 m一带河口处产卵，为海洋洄游性鱼类，生活于5～110m海域，幼鱼喜躲藏在漂浮物下面，成鱼则常与金线鱼、鰏鱼或对虾等混游［4-5］。肉食性，食物以水母及浮游动物为主。银鲳是名贵的海产食用鱼类之一，肉质细嫩且刺少，含丰富的蛋白质和脂肪，经济价值高，是网箱养殖的优良品种。

迄今为止，有关银鲳的研究主要集中在银鲳生物学、增养殖及分子克隆等方面，而银鲳的细胞遗传学及核型研究尚未见报道。本文采用PHA和秋水仙素腹腔注射、肾细胞直接制片法对银鲳染色体核型进行了初步研究，以期为该鱼的细胞遗传学特性研究提供数据资料，为探究该物种起源及进化地位及指导遗传育种生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用鱼为东海水产研究所福鼎基地人工繁殖的1龄银鲳，用于染色体组型分析的8 ind（4雌4雄）银鲳，体质量15～32 g。实验用鱼从福鼎基地养殖池中取出后，放入直径2 m的玻璃钢盆中，为防止银鲳出现应激反应，玻璃钢盆中事先加海水至80～100 cm，并加盖黑色的遮阳布。水温控制在25℃。

1.2 染色体标本制作

染色体标本制备采用林义浩［6］的体内注射肾细胞法，稍加修改，方法如下：

（1）注射PHA（植物血球凝集素）和秋水仙素。

自实验鱼胸鳍基部注射PHA溶液（0.9%NaCl配制浓度为1 000μg·mL-1），剂量10～15 μg·g-1（鱼体质量）；注射20～24 h后胸鳍基部注射秋水仙素溶液（0.9%NaCl配制浓度为1 000 μg·mL-1），剂量5～8μg·g-1（鱼体质量）。

（2）剪鳃失血。注射秋水仙素溶液2～4 h后，把实验鱼剪鳃放血5～10 min，鱼死前取出头肾、中肾，用生理盐水反复洗涤。

（3）制备细胞悬液。将肾组织块置于装有少许生理盐水的小烧杯中，用小剪刀剪碎肾组织，加入生理盐水，用100目尼龙纱绢过滤。

（4）离心洗涤细胞。将滤液移入离心管1 000 r·min-1离心 8 min。

（5）低渗处理。0.075 mol·L-1KCl低渗处理50～60 min。

（6）固定。在低渗液上加少许固定液（甲醇3：冰醋酸1，以下同），用吸管吹打混匀进行预固定3～4 min，随后1 000 r·min-1离心8 min（以下时间同）。再重复固定3次，每次20 min。

（7）滴片。将细胞悬浮液滴于预冷载玻片上，随后将载玻片在酒精灯上过火2～3次，自然干燥后用15%姬姆萨染色30 min，蒸馏水将反面冲洗干净，自然干燥后镜检。

1.3 染色体众数确定及组型分析

染色体众数及组型分析参照TAN等［7］的方法进行。稍加修改，方法如下：

（1）染色体计数

选取来自不同个体的100个分散良好的细胞，用显微镜（油镜下）进行观察、拍照，根据众数确定二倍体染色体数目。

（2）组型分析

挑选最好的10个数目完整、分散良好、长度适中（正中期）、着丝点清楚、2条单体适度分开、形态清晰的分裂相进行显微摄影，在相片上对每一条染色体确认着丝点位置，分别测量长臂和短臂，测量数据取其平均值。计算其相对长度、臂比值和着丝点指数，并按LEVAN［8］提出的标准进行配对、分类、排列组型。

2 结果

2.1 银鲳二倍体染色体数目

统计8 ind银鲳共100个中期分裂相的结果（表1），其中染色体总数为48的分裂相细胞占全部计数细胞的70%，由此确定银鲳的二倍体染色体数目为2N＝48（图1）。对于具有非众数染色体的分裂相，可能是低渗或滴片过程中少量染色体丢失而造成。

图1 银鲳的染色体中期分裂相（×1 000）Fig.1 Themetaphase chromosomes of Pampus argenteus（×1 000）

表1 银鲳染色体数目的分布Tab.1 Distribution of chromosome numbers of Pampus argenteus

2.2 银鲳的染色体组型

根据对银鲳染色体相对长度和臂比的统计结果（表 2），其全部染色体可配成 24对，按LEVAN命名法［8］分成4组，M组（中部着丝点染色体，r＝1.00～1.70）1对；SM组（亚中部着丝点染色体，r＝1.71～3.00）3对；ST组（亚端部着丝点染色体 r＝3.01～7.00）5对；T组（端部着丝点染色体，r＝7.01～∞）15对。按相对长度排列，制成银鲳染色体组型图（图2），核型公式为2N＝2M+6SM+10ST+30T，臂数（NF）＝56。从图2可以看出，在银鲳的SM组中，有一对相对本组其它染色体明显较大的染色体，除此之外，各相邻两对染色体之间无明显差异，大小呈递减趋势排列。4组染色体均未发现带有特殊标志性特征如随体、次缢痕的染色体，也未发现与性别决定有关的异形性染色体。

表2 银鲳染色体核型数据Tab.2 Numeral characteristics of the karyotype of Pampus argenteus show ing themean values ofmeasurements from ten bestm itoticmetaphases

图2 银鲳染色体组型（标尺 ＝5μm）Fig.2 The karyotype of Pampus argenteus（Bar＝5μm）

3 讨论

鲈形目种类繁多，是脊椎动物中种类最多的一个目（约7800种）［9］。目前已报道的鲈形目506种鱼类中二倍体的染色体数目及核型显示出一定的相似性：约60%的种类2N＝48，但在染色体组型和臂数上存在一定差异［10］。本文首次报道了鲳属鱼类染色体，对其核型进行了初步研究。银鲳M组染色体数为2，SM组染色体数为6，这一结果与舒琥等［11］报道的卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）染色体组型相似，染色体臂数相同，似乎说明这2种鱼的亲缘关系较近。而与舒琥等［12］报道的红鳍笛鲷（Lutjanus erythopterus）组型却存在一定出入，而且染色体臂数也有差异。相同之处是均未发现带有随体、次缢痕的染色体。这些现象反映了鱼类种间、类群间进化上的趋同性和变异性。但要判定鲈形目内的系统发育及亲缘关系，需要借助形态学、生化和分子生物学方法做进一步分析。王金星等［13］利用采自青岛和烟台近海的5种鲈形目鱼类所得到的核型均为2N＝48＝48T，与本文及上述报道差异很大，造成这些差异的原因可能是由于鲈形目不同种属染色体多态现象，但更有可能是由于不同种属内客观存在的染色体核型分化所致。

日本学者小岛吉雄对800余种已作核型研究的鱼类染色体进行研究发现［14］，高位类群的鱼类染色体的特点是其数目分布呈收敛状态较集中，局限在2N＝42～48的范围内，峰值是2N＝48，M型（包括M和SM染色体）少，A型染色体（包括ST和T染色体）多。银鲳2N＝48，M型染色体数目为8，A型染色体为40，NF＝56，为典型的高位类群染色体数目。因此，在鱼类系统上属于高位类群，与系统演化上的低位类群如鲤形目、鲶形目大多数种类核型中M型染色体所占比例大（超过 50%）、A型染色体比例小（小于50%）、NF值高的特点相比，有着明显的区别。

鱼类特别是淡水鱼类染色体组型的研究，国内外已有大量文献报道，还有专著出版［15］，但是海水鱼类染色体组型的报道则不多见，不到现存海洋鱼类的5%［16］，既分散又不系统。在已有核型报道的海洋鱼类中，2N＝48的占多数。鲳科鱼类染色体研究除本文报道的银鲳外尚未见其它报道，整个鲳科鱼类的核型特征还有待进一步研究。同时，海水鱼类细胞遗传学的系统研究应该进一步加强。

笔者在银鲳的染色体标本制备过程中，发现银鲳具有很强的应激反应，往往在操作后短短几个小时内鱼即死亡，给实验造成了很大困难。经过反复摸索，我们发现采用如下方法可有效减缓银鲳在实验过程中的应激反应：1）从暂养池捞鱼时，鱼全程不能离水，必须带水操作；2）注射PHA和秋水仙素时，事先用丁香酚麻醉实验鱼；3）注射药物时，尽量在水面下操作；4）注射药物后，实验鱼的暂养容器水位保持在80～100cm，上面遮盖黑色遮阳布避光。这个防应激的方法在同样具有强应激反应的刀鲚（Coilia ectenes），鲥鱼（Tenualosa reevesii）的实验操作中也可借鉴使用。

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