pH 对青蛤的钙化率和两种酶活性的影响

蔡 娟，周 凯，盛文权，隋延鸣，来琦芳，陆建学，么宗利，高鹏程

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，盐碱水域渔业工程技术研究中心，上海 200090；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

水体pH值是水产养殖过程中一个重要的环境因子，也是养殖环境的重要指标之一。pH高低直接影响水生动物的摄食、生长及生理代谢［1］，例如：短期的低 pH暴露会导致厚壳贻贝（Mytilus coruscus）生长速度减缓，能量积累减少［2］，氧化应激增强［3］，免疫水平降低［4］，最终导致厚壳贻贝摄食能力减弱［5］；GUO等［6］研究发现低pH会导致杂色鲍（Haliotis diversicolor）、皱纹盘鲍（H.discus hannai）以及葡萄牙牡蛎（Crassostrea angulata）受精率、幼虫壳长以及担轮幼虫和面盘幼虫等各阶段的表态率。然而，目前关于pH对青蛤（Cyclina sinensis）影响的报道甚少。青蛤是一种潮间带贝类，广泛的分布在中国、日本、韩国以及南亚各国的沿海滩涂［7］，其适宜盐度、温度范围广，生长速度快，因此从上世纪80年代开始青蛤已在中国沿海开始人工养殖。近些年，随着青蛤养殖技术的进一步成熟，内陆盐碱水青蛤养殖也逐渐展开［8］。在沿海滩涂的青蛤养殖面临海水酸化的威胁，而在内陆盐碱水养殖又面临高pH威胁，因此系统研究pH对青蛤的生理影响意义重大。

贝类体表外包被一层厚厚的石灰质贝壳，在其生长过程中贝壳也不断地延伸，因此贝类生长过程同时也被看作是一个生物钙化的过程［9］。海洋钙化生物的贝壳和骨架主要由CaCO3的两种晶体：文石和方解石构成，它们不会被海水溶解的原因是由于海水中含有过饱和的 Ca2+和［10］。当水体pH改变时含量随之变化，这会对贝类钙化率造成影响。碳酸酐酶（CA）是一种活性中心含有锌离子的金属酶，能够逆向催化CO2生成碳酸氢盐的水合反应，其在生物钙化和酸碱平衡方面发挥着重要的作用［11］。此外，环境因子（如pH、温度、溶氧及盐度）的改变［1，12-13］会引起生物体内发生氧化应激，为了应对应激生物体会调节体内抗应激相关酶活性。超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内重要的抗应激酶，它可以将机体内过多的O-2催化生成H2O2和O2，从而起到保护机体的作用［14］。大量研究表明当机体发生氧化应激时体内的超氧化物歧化酶（SOD）活性会有所变化［1，12-13］。因此，本实验从钙化、碳酸酐酶（CA）活性和超氧化歧化酶（SOD）活性3个方面来研究pH变化对青蛤的影响，以期为pH波动条件下的青蛤养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

实验用青蛤购自上海市铜川路水产市场，壳长为（3.5±0.5）cm、湿重为（13.6±1.2）g。将青蛤表面清洗后，移入盛有盐度15（模拟青蛤养殖栖息地盐度）人工海水的500 L塑料箱中。暂养期间，温度保持25℃，持续微充气，日换水量为1／2，投 喂 25 000 cells· mL-1牟 氏 角 毛 藻（Chaetocerosmueller）和微绿球藻（Nannochloropsis oculata）混合藻液，7 d后，选择健康、活性强、规格基本一致的个体进行实验。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计

本实验设置 5个 pH梯度：7.4、7.8、8.2、8.6、9.0（其中 pH 8.2为对照组），对高 pH的控制用Na2CO3和NaHCO3不同配比来实现，对低pH的控制通过导入CO2来实现。实验在50 L塑料箱中进行，每天投喂浓度25 000 cells·mL-1牟氏角毛藻和微绿球藻混合藻液5 L，半个小时后换水1／2。每个pH组设置3个重复，每个重复中50 ind青蛤，实验共进行7 d，分别在以下时间点进行取样：0 h、3 h、12 h、24 h、48 h、72 h、120 h、168 h。每个实验箱内随机取出5 ind青蛤，随即在准备好的冰盒上进行内脏团、外套膜、鳃等组织的采集。取样后一部分直接放置于-80℃冰箱中冷冻保存，另一部分按照质量体积比1∶9与0.9%生理盐水缓冲液混合匀浆，8 000 r·min-1离心后取上清液分装放置于-80℃冰箱保存。同时，每个实验容器取出3 ind青蛤转移入装有与处理相同pH海水的3 L塑料瓶中密封5 h，密封前后测定瓶内海水的总碱度，实验结束后解剖称量青蛤去贝壳后的湿重。

1.2.2 CA酶和SOD酶活性测定方法

CA酶测定在HENRY等［15］ΔpH法基础上加以改进。将贮存的青蛤组织置于预冷的Tris缓冲液中（甘露醇225 mmol·L-1，蔗糖75 mmol·L-1，Tris 10 mmol·L-1，用 15%磷酸调到 pH 7.4）在冰浴条件下匀浆后取适量的组织匀浆液，用预冷的Tris缓冲液稀释至8 mL组成反应缓冲体系，震荡混匀，插入pH电极开始监测反应缓冲体系pH值，待pH稳定后，加入240μL 0℃饱和CO2水溶液，即刻起，记录下降0.15个pH单位所用的时间（tenz）。酶催化反应的速率要减去不加酶的空白反应速率。酶活性标准单位用μmol CO2（mg·min）-1表示。一个酶活性单位（U）定义为在4℃反应体系重，起始pH值为7.4，添加240μL 0℃饱和CO2水溶液，pH值下降0.15所用的时间（tenz）为空白对照反应时间（t0）的一半时所需的酶量。酶活性单位计算公式：U＝t0·tenz-1。用 ΔpH转化为 μmol CO2·min-1的方法：用移液枪每次加10μL的0.1 mol·L-1HCl，直到媒介下降0.15单位pH，记录下所用的HCl量，在反应中 H+∶CO2＝1∶1，从而获得消耗 CO2的量。

SOD酶测定方法参照南京建成总超氧化物歧化酶试剂盒羟胺法测定。计算公式：SOD活性（U·mL-1）＝（对照组OD值-测定OD值）÷对照组÷50%×放映稀释倍数×样本测试前的稀释倍数。单位为：U·mgprot-1。

总蛋白含量采用微量酶标法（BCA）测定。计算公式：总蛋白浓度（μg·mL-1）＝（测定 OD值-空白OD值）÷（标准OD值-空白OD值）×标准品浓度（563μg·mL-1）×样本测试前稀释倍数。单位为：μg·mL-1。

1.2.3 钙化率的测定方法

钙化率的测定方法为碱度异常技术［16］，碱度测定采用酸碱滴定法［17］。钙化率的计算公式：

G＝（TA1-TA2）×V÷（2×T×M），单位为μmol·（g·h）-1。式中，G代表钙化率；TA1、TA2代表实验前后总碱度［单位：μmol·（g·h）-1］，T代表实验时间（单位：h）；M代表实验对象质量（单位：g）。碱度的计算公式：

式中，CHCl为滴定盐酸浓度，（单位：mol·L-1）；VT为消耗盐酸总体积（单位：mL）；AT为总碱度（单位：mmol·L-1）。

1.3 数据分析与处理

文中数据均使用平均值±标准差（Mean±SD）表示，用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）、Duncan法进行多重比较，显著性水平设置为P＝0.05。

2 结果与分析

2.1 pH对青蛤钙化率的影响

如图 1所示，与对照组 pH 8.2相比，pH 7.4、pH 8.6、pH 9.0 3个处理组钙化率显著降低（P＜0.05），而 pH 7.8组相较于对照组钙化率下降但差异不显著。这些结果表明，当pH降至7.8时青蛤钙化效率开始降低，当pH降至7.4时青蛤钙化显著地受到抑制。此外，pH上升同样会抑制青蛤钙化率，当pH达到时9.0时青蛤钙化率几乎为零。

图1 pH对青蛤钙化率的影响Fig.1 The effects of pH on the calcification rate in Cyclina sinensis

2.2 pH对青蛤两种酶（CA、SOD）活性的影响

2.2.1 pH对青蛤内脏团、外套膜、鳃CA酶活性的影响

由图2可知，在3 h、12 h、1 d、2 d、3 d，与对照组内脏团CA酶活性相比，［d2］pH 7.4组内脏团CA酶活性在各时间点均显著上升（P＜0.05）；pH 9.0组内脏团CA酶活性在12 h、1 d与对照组内脏团相比有显著上升（P＜0.05）。其余时间段，各个试验组与对照组均无显著性差异。

图2 pH对青蛤内脏团碳酸酐酶活性的影响Fig.2 The effects of pH on CA enzyme activity in the visceralmass of Cyclina sinensis

由图3可知，在12 h、1 d pH 7.4组和pH 9.0组与对照组外套膜CA酶活性相比显著上升（P＜0.05），其余各个时间段各个试验组与对照组差异均不显著。

图3 pH对青蛤外套膜碳酸酐酶活性的影响Fig.3 The effects of pH on CA enzyme activity in themantle of Cyclina sinensis

由图4可知，与对照组鳃CA酶活性相比，在3 h、12 h、1 d、2 d、3 d时间段中，pH 7.4组鳃 CA酶活性显著升高（P＜0.05）；而在 12 h、1 d、2 d时间段中，pH 9.0组鳃CA酶活性显著升高（P＜0.05）。

图4 pH对青蛤鳃碳酸酐酶活性的影响Fig.4 The effects of pH on CA enzyme activity in the gill of Cyclina sinensis

2.2.2 pH对青蛤内脏团、外套膜、鳃SOD酶活性的影响

由图5可知，与对照组内脏团SOD酶活性相比，在12 h和 1 d pH 7.4组、pH 9.0组内脏团SOD酶活性显著上升（P＜0.05），其余各时间段各组间均无显著性差异。

图5 pH对青蛤内脏团SOD酶活性的影响Fig.5 The effects of pH on SOD enzyme activity in the visceralm ass of Cyclina sinensis

由图6可知，与对照组外套膜SOD酶活性相比，在12 h、1 d两个时间段 pH 7.4组和 pH 9.0组SOD酶活性出现显著升高（P＜0.05），其余各个阶段各试验组与对照组相比均无显著差异（P＞0.05）。

图6 pH对青蛤外套膜SOD酶活性的影响Fig.6 The effects of pH on SOD enzyme activity in themantle of Cyclina sinensis

由图7可知，与对照组鳃SOD酶活性相比，在12 h、1 d两个时间段pH 7.4组和pH 9.0组鳃SOD酶活性出现显著升高（P＜0.05），其余各个阶段各试验组与对照组均无显著差异（P＞0.05）。

图7 pH对青蛤鳃超氧化歧化酶活性的影响Fig.7 The effects of pH on SOD enzyme activity in the gill of Cyclina sinensis

3 讨论

3.1 pH对青蛤钙化率的影响

本实验结果表明，pH改变后青蛤钙化率也随之变化，当pH降至7.8时，青蛤钙化率随之降低，当pH进一步降低时青蛤钙化效率进一步出现显著性下降。相较于pH降低，pH升高对青蛤钙化影响更为明显，表现为pH升至9.0时青蛤钙化率几乎降至零。目前关于pH降低对贝类钙化效率影响的研究屡见报道，如栉孔扇贝（Chlamys farreri）的钙化率随着酸化加剧而降低，当pH下降到7.9时其钙化率下降33%，当 pH继续下降至 7.3时钙化率趋近于0［18］。MILER等［19］研究发现海水pH降低对不同贝类钙化作用的影响程度不同，pH在7.7～8.1范围内，美洲牡蛎（C.virginica）幼虫的贝壳面积减少16%，钙质在贝壳中所占比例下降了近一半；而近江牡蛎（C.ariakensis）的钙化活动仍能正常进行。由此可见，pH对贝类钙化率的影响有一定的种间差异性。当海水吸收了大量CO2，pH下降，导致其中碳酸根含量降低，而海水中钙离子浓度相对稳定，因此海水中碳酸钙饱和度Ω降低，直接导致了贝类钙化效率的降低，本实验结果也基本反映了这一现象；反之，当海水pH升高时，海水中碳酸根含量升高，碳酸钙饱和度Ω升高，理论上有利于贝类钙化效率。［d5］

3.2 不同pH对青蛤两种酶（CA、SOD）活性的影响

3.2.1 不同pH对青蛤内脏团、外套膜、鳃CA酶活性的影响

碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）是一种Zn2+结合金属酶，催化 CO2水解可逆反应（CO2+H2O↔HCO-3+H+），具有广泛的生物学功能，参与诸多生命活动如酸碱平衡调节［20］、离子运输［21］、渗透压调节［22］以及生物矿化［23］等。本研究显示，当pH在7.8～8.6幅度内变化时，各组织CA活性变化不大，表明遭遇小幅度的pH波动对青蛤的生理影响并不大。3种组织中内脏团CA活性最高，外套膜次之，鳃组织CA酶活性最低。与对照组相比，pH 7.4时青蛤内脏团、鳃组织中CA活性出现差异的时间段是在3 h～3 d，而外套膜CA活性仅仅在12 h～1 d出现差异；在pH 9.0组内脏团CA酶活性出现差异的时间段是在3 h～3 d，持续的时间与pH 7.4组相同，鳃CA酶活性出现差异的时间段是在12 h～2 d，外套膜CA酶活性出现差异的时间段是在12 h～1d，持续时间最短。类似的报道同样出现在菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）中，VELEZ等［24］发现经历7 d pH 7.3暴露，菲律宾蛤仔 CA活性显著地上升之后迅速恢复正常；但是相反的结果出现在长牡蛎（C.gigas）中，MOREIRA等［25］证实，pH 7.3暴露会明显抑制牡蛎 CA活性。针对这两种截然不同的结果，笔者推测这可能归咎于物种生存习性的差异，菲律宾蛤仔和青蛤生活于滩涂中而牡蛎附着于潮间带岩石上，相较于潮间带，滩涂环境因子变化更加多样频繁，造就了物种更强的适应能力。［d6］目前关于高pH对贝类碳酸酐酶报道甚少，本课题组用高pH环境胁迫凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）发现其鳃在高碳酸盐碱度胁迫的第1天CA基因表达量上升为对照组的30倍，之后在第2天回落到初始水平［26］。而本次实验青蛤需要3 d CA的活性才恢复原水平，说明青蛤相较于凡纳滨对虾应对pH变化的机理可能有一定的差别。

3.2.2 pH对青蛤内脏团、外套膜、鳃SOD酶活性的影响

SOD酶是生物体内重要的抗应激因子，其主要作用是清除机体过多的超氧阴离子（O-2）。在生物体内超氧阴离子来源于线粒体代谢副产物［27］，一定量的超氧阴离子可以帮助机体清除凋亡细胞、杀死细菌、维持机体稳定［28］，但当机体受到环境胁迫时（温度、盐度、pH等）线粒体代谢会产生过多O-2［29-30］，而过多的O-2会破坏DNA结构，氧化细胞膜给机体带来一系列的伤害［4］。为了控制体内O-2水平，机体会调节SOD酶活性来清除过多的O-2以保证机体处于健康状态。在低pH胁迫方面，大量的报道表明，低酸暴露贝类SOD酶活性经历一个先升高后恢复的过程［1，3］，同样在本实验中青蛤经历pH7.4暴露后鳃、内脏团以及外套膜SOD酶活性都呈现一个先升高后恢复过程。这可能由于青蛤在刚经历低pH暴露后其机体代谢会产生大量的O-2继而诱导SOD酶活性提升，随着时间的延续机体适应了低pH因此代谢过程中产生O-2随之降低而恢复到正常水平，因此SOD酶活性也恢复至原先的水平。高pH胁迫对贝类的影响目前研究甚少，LIN等［8］指出长期的高pH胁迫会导致青蛤血细胞数目降低，吞噬能力减弱，但对抗应激相关蛋白的研究并无报道。本实验结果表明，高pH暴露青蛤各组织SOD酶活性同样会经历一个先升高后恢复过程，笔者推测其原因与低pH暴露类似。

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