海七鳃鳗CXCL8基因的原核表达及蛋白纯化

朱欣云，丁少青，张 哲，任建峰，2，濮家飞，贾 亮，李伟明，张庆华，2

（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.上海海洋大学，水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306；3.密歇根州立大学渔业与野生生物系，东兰辛，密歇根，美国 4883224）

趋化因子是一类具有趋化功能和活化作用的小分子分泌型蛋白质，由单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等多种细胞分泌产生，分子量大小通常为8～15 kDa。趋化因子在从最低等的鱼类到哺乳类的整个脊椎动物中均有广泛的表达，它们的起源甚至可以追溯到距今约5.2亿年前古老的脊索动物文昌鱼（Branchiotoma belcheri）［1］。趋化因子在炎症反应、病原体感染及清除、细胞及器官发育、创伤修复、肿瘤形成及转移、移植排异等方面都起着重要的作用［2］。目前已在人和小鼠中发现近50种趋化因子，根据氨基酸序列中N端保守的半胱氨酸残基（Cys）的数目和位置的差别，将哺乳动物中的趋化因子分为4个类型：CC型、CXC型、C型和 CX3C型［3］。2008年，PEATMAN等［4］在斑马鱼（Danio rerio）中又发现一种特有的CX型趋化因子，该亚类共有4个成员，到目前为止，斑马鱼中共发现111种趋化因子，这可能与斑马鱼的基因组中有一次额外的基因加倍有关［5-6］。趋化因子作为配体通过和细胞膜上的受体相结合而发挥相应的生物学作用［7］。

CXCL8，又称为白细胞介素8（interleukin 8，IL-8），是常见的趋化因子，属于C-X-C型亚家族。1987年，YOSHIMURA等［8］从细菌刺激后的人外周血单核细胞的上清液中分离纯化得到第一个趋化因子CXCL8，发现其对中性粒细胞有趋化作用，因此被命名为粒细胞激活因子。之后的研究认为其属于白细胞介素家族成员，在1988年伦敦学术会议上将该因子确定为中性粒细胞活性肽（Neutrophil Alkaline Phosphatase）／CXCL8。迄今为止，在许多脊椎动物中都已鉴定到CXCL8的基因，包 括 人 （Homo sapiens）［9］、鸡 （Gallus gallus）［10］、爪蟾（Xenopus laevis）［11］、斑马鱼［12］和河七鳃鳗（Lampetra fluviatilis）［13］。CXCL8是促炎性细胞因子，能够趋化中性粒细胞到达炎症部位，促使其脱颗粒，引起呼吸暴发反应；并激活炎性细胞，如：吞噬细胞，促进急性期蛋白合成，参与炎症反应，引起发热。进一步研究发现CXCL8能够对不同类型的细胞产生作用，促进炎症反应进程、诱导血管的生成、促进细胞有丝分裂、调节免疫功能等，与多种炎症反应性疾病、免疫性疾病以及肿瘤的发生和发展有着密切的关系［9］。

七鳃鳗属圆口纲（Cyclostomata），七鳃鳗目（Petromyzoniformes），七鳃鳗科（Petromyzontidae），为无颌类脊椎动物。七鳃鳗是目前所存的最古老的无颌类脊椎动物之一，是联系无脊椎动物与脊椎动物的重要桥梁，其免疫系统介于无脊椎动物（只拥有先天免疫）和硬骨鱼（部分获得性免疫）之间［14］，对其免疫系统的研究在理论上有着重要的进化意义。虽然目前已确定的七鳃鳗有38种，但经常以全基因组测序已经完成的海七鳃鳗（Petromyzon marinus）和日本七鳃鳗（Lethenteron japonicum）作为典型代表［15］。本研究通过PCR方法得到海七鳃鳗CXCL8的cDNA序列，成功构建了原核表达载体，并诱导表达出PmCXCL8重组蛋白，以期为进一步研究海七鳃鳗CXCL8的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

pCold I质粒、克隆载体 PMD19-T、感受态细菌DH5α和BL21购买于TaKaRa公司，感受态细菌Rosetta（DE3）和海七鳃鳗肝组织cDNA为本实验室保存。

1.2 主要试剂和仪器

Profinia IMAC蛋白质纯化试剂盒购买于BIO-RAD公司；Penta-His Antibody（Code：34660）抗体购买于 QIAGEN公司；HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG（Code：61-6520）抗体购买于 Invitrogen公司；超声破碎仪器（SONICS公司，VCX150），蛋白质纯化仪（BIO-RAD公司，Profinia）。

1.3 引物设计

根据已知的海七鳃鳗基因组信息（http：／／www.ensembl.org／index.html），通过 blast方法找到海七鳃鳗的CXCL8（PmCXCL8）基因的开放阅读框（open reading frame，ORF）序列，设计出一对引物，上游引物加入NdeI酶切位点，下游引物加入HindⅢ酶切位点，引物序列如下：

CXCL8-F：5’-TCGAAGGTAGGCATATGACG ATGAACGCCAAGCT-3’

CXCL8-R：5’-GCAGGTCGACAAGCTTTCAC GGCGTGGGTTTGGGTG-3’

1.4 目的基因的扩增及分析

使用 Tks GflexⓇDNA Polymerase，以海七鳃鳗肝cDNA为模板进行PCR扩增，使用25μL PCR体系：Premix 12.5μL，ddH2O 9.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，cDNA 1μL。反应条件：94℃，2 min；98℃，10 s；60℃，30 s；72℃，2 min；30个循环，72℃10 min，4℃延伸。取5μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，同时取100μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0切胶回收目的片段，取10μL胶回收产物送测序。

将PCR得到的PmCXCL8基因序列在National Center of Biotechnology Information（NCBI）网站上（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST）进行序列比对，使用 SignalP 4.1 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）进行信号肽预测，使用DNAMAN 8.0进行氨基酸序列比对，使用MEGA 6.0构建系统进化树。

1.5 表达载体的构建

将1.4中胶回收后的目的片段和pColdI质粒使用NdeⅠ酶和HindⅢ酶进行双酶切过夜，回收酶切后的产物，使用In-FusionⓇHD Cloning Kit连接4 h，连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞中，涂布平板，37℃过夜培养，挑取阳性克隆，提取质粒，送测序进行鉴定，原核表达载体命名为pCold-CXCL8。

1.6 重组蛋白的诱导表达及检测

将pCold-CXCL8质粒和pColdI空载质粒分别转入 E.coli BL21和 Rosetta（DE3）菌株中。分别挑取单克隆培养成种子液，然后使用5 mL LB／Amp（100μg·mL-1）培养基，37℃培养至OD600nm值约为0.6，15℃静置15 min，添加100 mM IPTG 50μL（终浓度为1 mM）进行诱导，15℃继续培养22 h。收集菌体后进行超声波破碎和离心分离。取各变性后的样品（全蛋白、上清、沉淀）8μL（0.05 OD相当），进行 SDS-PAGE电泳，使用CBB-R250染色检测。同时进行SDSPAGE电泳及Western blot实验，一抗使用Penta-His Antibody（1∶3000稀释），二抗使用 HRPRabbit Anti-Mouse IgG（1∶3000稀释），使用化学发光法显色检测。

1.7 重组蛋白的纯化及检测

用1.6中培养的400 mL带有pCold-CXCL8载体的Rosetta（DE3）感受态菌液，诱导表达重组蛋白，对菌体超声破碎后离心收集上清，使用Bio-Rad IMAC蛋白质纯化试剂盒和Profinia蛋白质纯化系统进行纯化，纯化方法参照说明书进行，纯化后的蛋白以相同的条件进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。

2 结果与分析

2.1 海七鳃鳗CXCL8基因扩增结果及序列分析

PCR结果显示在大约300 bp的位置扩增出单一条带，与预期的大小一致（图1）。测序结果表明PmCXCL8基因的ORF为309 bp，该基因编码102个氨基酸，分子量为11.23 kDa，等电点为9.37。经预测，PmCXCL8信号肽切割位点在第23位和第24位氨基酸之间，前23个氨基酸序列属于信号肽部分（图2-a）。在与人（Homo sapiens，P10145.1）、猴（Macaca mulatta，P67813.1）、土拨鼠 （Marmota monax，ABY67262.1）、牛 （Bos taurus，P79255.1）、猪（Sus scrofa，P26894.1）和兔（Oryctolagus cuniculus，P19874.2）这 6种哺乳动物，鸡（Gallus gallus，P08317.1）、灰雁（Anser anser，ABD49205.1） 和 鸽 子 （Columba livia，ABD49206.1） 这 3 种 鸟 类， 黑 线 鳕（Melanogrammus aeglefinus，CAD97422.2）、大西洋鳕 （Gadus morhua，ABV59376.1）、虹 鳟（Oncorhynchus mykiss，CAC83945.1）、草 鱼（Ctenopharyngodon idella，AEM05971.1）、斑马鱼（Danio rerio，CCQ 71734.1）、鲤（Cyprinus carpio，BAH98111.1）、 河 豚 （Takifugu rubripes，BAD26621.1）、大 黄 鱼 （Larimichthys crocea、AKM12660.1）、牙 鲆 （Paralichthys olivaceous，AAL05442. 1）、 鲶 （Ictalurus punctatus，AKQ06246.1）、 真 鲷 （Pagrus major，AHC69388.1）、条 石 鲷 （Oplegnathus fasciatus，AHC69385.1）和 青 鳉 （Oryzias latipes，XP_004065776.1）这 13种鱼类及爪蟾 （Xenopus laevis，AEB96252.1）与 河 七 鳃 鳗 （Lampetra fluviatilis，CAA13114.1）的氨基酸序列进行比对后发现，该氨基酸序列上存在有与其它趋化因子相同的4个保守的半胱氨酸残基的典型排列，分别为 C36、C38、C63与 C80位点，同时发现在PmCXCL8的 CXC基序前没有 ELR（Gly-Gly-Arg）基序，而由 GGR（Gly-Gly-Arg）基序所替代（图2-b）。与七鳃鳗、硬骨鱼类和其它脊椎动物的CXCL8氨基酸序列进行系统发生分析后发现，海七鳃鳗和河七鳃鳗的CXCL8的亲缘关系最近，相似度达95%，聚为一支，并与硬骨鱼类聚为一总支，同时在此总支内未与其它鱼类聚为同一亚支（图3）。

图1 RT-PCR扩增PmCXCL8基因序列Fig.1 RT-PCR amplified fragment of Pm CXCL8

图2 海七鳃鳗CXCL8鉴定和特征描述Fig.2 Identification and characterization of PmCXCL8

图3 CXCL8氨基酸序列系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic analysis of CXCL8 predicted sequences

图4 pCold-CXCL8表达产物SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expressed product of pCold-CXCL8

2.2 重组蛋白的诱导表达

2.2.1 SDS-PAGE结果

SDS-PAGE电泳结果显示，转入重组质粒pCold-CXCL8的 E.coli BL21和 Rosetta（DE3）经IPTG诱导后，在预期位置（PmCXCL8重组蛋白预测的分子量为14.23 kDa）有1条蛋白条带，而插入空载体的菌株诱导后未出现该条带（图4）。结果表明重组质粒pCold-CXCL8在E.coli BL21和Rosetta（DE3）中诱导表达了目的蛋白，而且，在E.coli Rosetta（DE3）中表达的条带比 E.coli BL21深，在上清中条带要比沉淀中深，说明目的蛋白在E.coli Rosetta（DE3）中获得了更好的可溶性表达。

2.2.2 Western blot结果

使用Penta-His Antibody鼠单克隆抗体对重组蛋白进行Western blot鉴定，结果显示，在预期（PmCXCL8重组蛋白预测分子量为14.23 kDa，其中融合头大小为3 kDa，故目的蛋白的分子量为11.23 kDa）位置有单一的条带（图5）。说明有目的蛋白表达，在E.coli Rosetta（DE3）中条带比E.coli BL21中要深，说明在 E.coli Rosetta（DE3）中的表达结果优于E.coli BL21，之后利用E.coli Rosetta（DE3）作为后续蛋白表达及纯化的表达系统。

2.3 重组蛋白的纯化

经E.coli Rosetta（DE3）蛋白表达系统诱导表达后得到目的蛋白，使用Bio-Rad IMAC蛋白质纯化试剂盒和Profinia蛋白质纯化系统进行纯化后，测得浓度为0.04 mg·mL-1，用 SDS-PAGE胶（图6-a）和 Western blot（图 6-b）检测，可发现清晰、明显的目的蛋白条带，经Bio-Rad Image Lab 5.1软件分析，目的蛋白纯度大于85%。

图5 pCold-CXCL8表达产物W estern blot分析Fig.5 W estern b lot analysis of the expressed p roduct of pCold-CXCL8

3 讨论

细胞趋化因子CXCL8在哺乳动物的炎症反应中将白细胞招募至炎症位点的过程中起着重要作用［16］，且其趋化活性已在鲤、斑马鱼、虹鳟、牙鲆和大黄鱼中利用重组蛋白得到验证［17-20］。到目前为止，虽在河七鳃鳗中已鉴定出CXCL8基因，但其趋化功能未见报道。本研究从海七鳃鳗中发现并鉴定出与其它物种具有同源性的CXCL8蛋白，经分析，该蛋白拥有4个半胱氨酸位点，对于其形成特定的三级结构并发挥CXC趋化因子功能极其重要，靠近N端的2个半胱氨酸残基之间被1个谷氨酰胺残基隔开，这些特点均与其它物种的CXC趋化因子亚家族一致［21］。海七鳃鳗CXCL8与河七鳃鳗CXCL8氨基酸序列有95%的一致性，而且它们的分子结构中均没有ELR基序，这一特点也与除了黑线鳕和大西洋鳕之外的大多数鱼类相一致［1］。ELR基序在哺乳动物中起着招募中性粒细胞、促进血管再生的作用［22］。PmCXCL8分子中的 ELR结构的相应位置由GGR三肽基序所替代，这是否影响PmCXCL8的趋化功能还有待深入研究。

图6 纯化后SDS-PAGE电泳和W estern blot分析Fig.6 SDS-PAGE and W estern blot analysis of protein purification

系统发生分析后发现，PmCXCL8与硬骨鱼类聚为一总支，除与河七鳃鳗聚为一支外，未与任何其它鱼类聚为一支，这一结果与其进化地位相一致，七鳃鳗开始拥有原始的CXCL8，其与硬骨鱼类CXCL8在序列上都较为相似，故有可能是从某一共同的基因进化而来。七鳃鳗作为非脊椎动物与脊椎动物之间的过度物种，一直以来被认为是活化石［14］，海七鳃鳗可以作为研究世界范围内七鳃鳗发育、免疫和进化的良好模型，本研究结果也进一步突显出七鳃鳗在探究高度保守的先天性免疫的进化中的重要作用。

大肠杆菌原核表达系统具有使用方便和成本低廉的优点，研究水生动物基因功能时常用到该表达系统，2011年齐志涛等［23］研究报道了通过原核表达系统成功表达出非洲爪蟾干扰素-λ1基因的重组蛋白，2014年韦友传等［24］研究报道了通过原核表达系统成功表达出斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）MyD88的重组蛋白。2014年刘爽等［25］研究报道了通过原核表达系统成功表达出日本七鳃鳗IL-17的重组蛋白。但是，有些基因仍会出现表达困难或者表达的蛋白以不可溶的包涵体形式存在等问题。冷休克表达载体pCold系列应用冷休克基因之一的cspA基因启动子设计而成，可以有效表达蛋白，通过低温诱导可明显减慢细胞内蛋白表达速率，降低二硫键错误折叠几率，使目的蛋白获得更好的可溶性表达［26-27］。2008年 刘 薇［28］研 究 报 道，使 用pCold载体可以有效提高小牛凝乳酶基因在大肠杆菌中的可溶性表达。本研究结果显示使用pColdI载体，可以在细菌培养的上清中发现PmCXCL8重组蛋白有较高的可溶性表达，为后续纯化蛋白提供了很好的基础。E.coli Rosetta（DE3）菌株含有 pRARE质粒，能够提供 AUA，AGG，AGA、CUA、CCC和 GGA稀有密码子的tRNA，使得该宿主菌相对于其它大肠杆菌，提高了真核细胞蛋白的表达水平［29］。2009年尹春光等［30］研究报道，使用 E.coli Rosetta（DE3）菌株，可以提高人Mx基因重组蛋白的表达，有利于改善外源蛋白由于存在稀有密码子低效表达的问题。本研究同时使用 E.coli BL21和 Rosetta（DE3）菌株进行对比，结果发现在 E.coli Rosetta（DE3）菌株中目的蛋白表达量明显高于E.coli BL21菌株组，这进一步为后续纯化蛋白提供了良好的条件。

本研究首次在大肠杆菌原核表达系统中表达出海七鳃鳗的CXCL8蛋白，发现PmCXCL8与河七鳃鳗的CXCL8蛋白高度相似，相较于哺乳动物，其进化地位与硬骨鱼类更为接近，为七鳃鳗的天然免疫系统进化研究奠定了基础。同时使用了Bio-Rad IMAC蛋白质纯化试剂盒和Profinia蛋白质纯化系统获得较高纯度的蛋白，为今后开展PmCXCL8功能研究提供了重要工具和手段。

［1］ CHEN J，XUQ，WANG T，etal.Phylogenetic analysis of vertebrate CXC chemokines reveals novel lineage specific groups in teleost fish［J］.Developmental＆Comparative Immunology，2013，41（2）：137.

［2］ ZLOTNIK A，YOSHIEO.The chemokine superfamily revisited［J］.Immunity，2012，36（5）：705-716.

［3］ SOKOL C L，LUSTER A D.The chemokine system in innate immunity［J］. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology，2015，7（5）.

［4］ PEATMAN E，LIU Z.CC chemokines in zebrafish：evidence for extensive intrachromosomal gene duplications［J］.Genomics，2006，88（3）：381-385.

［5］ ALEJO A，TAFALLA C.Chemokines in teleost fish species［J］. Developmental ＆ Comparative Immunology，2011，35（12）：1215-1222.

［6］ NOMIYAMA H，HIESHIMA K，OSADA N，et al.Extensive expansion and diversification of the chemokine gene family in zebrafish：identification of a novel chemokine subfamily CX［J］. BMC Genomics，2008（9）：222.

［7］ BIRD S，TAFALLA C.Teleost chemokines and their receptors［J］.Biology（Basel），2015，4（4）：756-784.

［8］ YOSHIMURA T，MATSUSHIMA K，OPPENHEIM J J，et al.Neutrophil chemotactic factor produced by lipopolysaccharide（LPS）-stimulated human blood mononuclear leukocytes：partial characterization and separation from interleukin 1（IL 1）［J］.Journal of Immunology，1987，139（3）：788-793.

［9］ MUKAIDA N.Interleukin-8：an expanding universe beyond neutrophil chemotaxis and activation［J］.International Journal of Hematology，2000，72（4）：391.

［10］ WU Y F，SHIEN JH，YIN H H，et al.Structural and functional homology among chicken， duck，goose，turkey and pigeon interleukin-8 proteins［J］.Veterinary Immunology＆Immunopathology，2008，125（3-4）：205.

［11］ CUIX，HAN Y，PAN Y，et al.Molecular cloning，expression and functional analysis of interleukin-8（IL-8） in South African clawed frog（Xenopus laevis） ［J］. Developmental ＆ Comparative Immunology，2011，35（11）：1159-1165.

［12］ DEVRIES M E，KELVIN A A，XU L，et al.Defining the origins and evolution of the chemokine／chemokine receptor system ［J］. Journal of Immunology，2006，176（1）：401.

［13］ NAJAKSHIN A M，MECHETINA LV，ALABYEV B Y，et al. Identification of an IL-8 homolog in lamprey（Lampetra fluviatilis）：early evolutionary divergence of chemokines［J］.European Journal of Immunology，1999，29（2）：375-382.

［14］ GUO P，HIRANO M，HERRIN B R，et al.Dual nature of the adaptive immune system in lampreys［J］.Nature，2009，459（7248）：796-801.

［15］ SHIMELD S M，DONOGHUE P C.Evolutionary crossroads in developmental biology：cyclostomes（lamprey and hagfish）［J］.Development，2012，139（12）：2091.

［16］ LIN F，NGUYEN CM，WANG S J，et al.Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced bymean IL-8 concentration［J］.Biochemical＆Biophysical Research Communications，2004，319（2）：576-581.

［17］ KURATA O，WADA S，MATSUYAMA T，et al.NTerminal region is responsible for chemotaxisinducing activity of flounder IL-8［J］.Fish＆Shellfish Immunology，2014，38（2）：361-366.

［18］ MONTERO J，COLL J，SEVILLA N，etal.Interleukin 8 and CK-6 chemokines specifically attract rainbow trout（Oncorhynchus mykiss） RTS11 monocytemacrophage cells and have variable effects on their immune functions ［J］. Developmental ＆Comparative Immunology，2008，32（11）：1374-1384.

［19］ VAN DER AA L M，CHADZINSKA M，GOLBACH L A， et al.Pro-inflammatory functions of carp CXCL8-like and CXCb chemokines ［J］.Developmental＆ Comparative Immunology，2012，36（4）：741-750.

［20］ DE OLIVEIRA S，REYES-ALDASORO C C，CANDEL S， et al. Cxcl8 （IL-8） mediates neutrophil recruitment and behavior in the zebrafish inflammatory response［J］.Journal of Immunology，2013，190（8）：4349-4359.

［21］ LAING K J，SECOMBES C J.Chemokines［J］.Developmental＆ Comparative Immunology，2004，28（5）：443-460.

［22］ WUYTS A，PROOST P，LENAERTS J P，et al.Differential usage of the CXC chemokine receptors 1 and 2 by interleukin-8，granulocyte chemotactic protein-2 and epithelial-cell-derived neutrophil attractant-78［J］.European Journal of Biochemistry，1998，255（1）：67-73.

［23］ 齐志涛，高 谦，张启焕，等.非洲爪蟾干扰素-λ1基因的原核表达［J］.水生生物学报，2011，35（6）：1060-1062.QIZ T，GAO Q，ZHANG Q H，et al.Prokaryotic expression in E.coli of Xenopus tropicalis interferonλ1 gene［J］.Acta Hydrobiologica Sinica，2011，35（6）：1060-1062.

［24］ 韦友传，孙宝宝，陆专灵，等.斜带石斑鱼MyD88基因的原核表达及蛋白纯化［J］.水生生物学报，2014，38（1）：200-202.WEIY C，SUN B B，LU Z L，et al.Prokaryotic expression and protein purification of the Myd88 gene in grouper Epinephelus coioides ［J］. Acta Hydrobiologica Sinica，38（1）：200-202.

［25］ 刘 爽，唐玉林，逄 越，等.日本七鳃鳗IL-17基因原核表达、蛋白纯化及多抗制备与鉴定［J］.免疫学杂志，2014（7）：636-640.LIU S，TANG Y L，PANG Y，et al.Prokaryotic expression， purification， and polyclonal antibody preparation of IL-17 from Lampetra japonica［J］.Immunological Journal，2014（7）：636-640.

［26］ QING G，MA L C，KHORCHID A，et al.Coldshock induced high-yield protein production in Escherichia coli［J］.Nature Biotechnology，2004，22（7）：877-882.

［27］ XIA B，ETCHEGARAY JP，INOUYEM.Nonsense mutations in cspA cause ribosome trapping leading to complete growth inhibition and cell death at low temperature in Escherichia coli［J］.Journal of Biological Chemistry，2001，276（38）：35581.

［28］ 刘 薇.小牛凝乳酶基因在大肠杆菌中可溶性表达研究［D］.哈尔滨：哈尔滨工业大学，2008.LIUW.The research of calf-chymosin gene soluble expression in E.coli［D］.Harbin：Harbin Institute of Technology，2008.

［29］ TEGEL H，TOURLE S，OTTOSSON J，et al.Increased levels of recombinant human proteins with the Escherichia coli strain Rosetta（DE3）［J］.Protein Expression＆ Purification，2010，69（2）：159.

［30］ 尹春光，杜立新，赵桂平，等.Mx基因稀有密码子和mRNA结构及大肠杆菌表达优化［J］.遗传，2009，31（1）：75-82.YIN C G，DU L X，ZHAO G P，et al.Optimizing the expression of Mx gene in Escherichia coli based on rare codon and mRNA structure［J］.Hereditas，2009，31（1）：75-82.