hβ-NGF基因真核表达载体构建及亚细胞定位

杨 智，赵冬梅，任秀敏，桑 川，尹兴忠，程春凤*

(1.佳木斯大学附属第二医院 神经内科，黑龙江 佳木斯154004；2.佳木斯大学附属第一医院 儿科；3.佳木斯大学附属第一医院 神经内科；4.佳木斯大学基础医学院解剖学教研室)

近年来随着重组DNA技术的迅猛发展，使NGF基因治疗阿尔茨海默病(AD)等认知障碍性疾病成为可能[1]。然而，NGF基因治疗所编码的蛋白在细胞内是如何定位的，其与蛋白合成、加工修饰、靶向转运及生物效应之间关系尚不明确[2]。本研究拟构建hβ-NGF基因的真核表达载体，采用融合EGFP标记和生物信息学分析两种方法，检测其在HEK293细胞中的定位。

1 材料与方法

1.1材料HEK293细胞、pEGFP-N1质粒由本实验室保存。DNA提取、PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶购自大连宝生物公司；凝胶回收、产物纯化、质粒提取、DH5α菌购自北京天根公司；Lip2000试剂购自Invitrogen公司；引物合成及测序由上海生工公司完成。

1.2方法

1.2.1pEGFP-N1-hβ-NGF真核表达载体的构建 以人血基因组DNA为模板，设计合适引物P1： 5’-TGTAGATCTTGCATAGCGTAATGTCCATGTGTTC-3’和P2：5’-TGAAAGCTTTCGGCAGGTCAGGCTCTTCTCAC-3’(下划线为BglⅡ、HindⅢ酶切位点,全长744 bp) 进行PCR扩增。PCR产物凝胶电泳鉴定后纯化回收，双酶切，T4 DNA酶连接，转化DH5α菌于A+板，挑白色菌落摇菌增殖，提取重组质粒行酶切和测序鉴定。

1.2.3hβ-NGF基因编码蛋白生物信息学分析和亚细胞定位 从GenBank中搜索hβ-NGF基因编码区核苷酸及氨基酸序列， PortParam分析蛋白理化性质，ProtScale分析亲/疏水性，SignalP预测信号肽，UniProtKB/Swiss-Prot数据库分析结构功能域、翻译后修饰位点，进一步分析亚细胞定位。

2 结果

2.1pEGFP-N1-hβ-NGF载体的构建PCR扩增hβ-NGF编码序列，获得约750 bp的特异性条带，与预期结果符合。重组质粒经BglⅡ和HindⅢ双酶切后，可见750 bp和4.7 kb两条带。测序证实真核表达载体pEGFP-N1-hβ-NGF构建成功。

2.2pEGFP-N1-hβ-NGF融合蛋白表达和定位HEK293细胞转染24 h后，对照组无EGFP表达，空载组EGFP均匀分布于细胞内(图1A1)，实验组融合EGFP不存在于细胞核内，部分存于细胞质中(图1 A2)。Image J软件对两组荧光图片进行半定量分析(图1 B)，与空载组比较，实验组细胞平均光密度值减少(P<0.05)，与图1 A2结果一致。

图1 pEGFP-N1-hβ-NGF融合EGFP表达定位和半定量分析(与空载组相比*P<0.05)

2.3hβ-NGF基因编码蛋白生物信息学分析和亚细胞定位

hβ-NGF基因编码区长726 bp，可编码241个氨基酸肽链。经ProtParam、ProtScale、SignalP分析hβ-NGF肽链是可溶、不稳定的分泌型蛋白。UniProtKB/Swiss-Prot将hβ-NGF肽链划分为信号肽(aa 1-18)、前导肽(aa 19-121)及功能肽(aa 122-241) 3 段：前导肽包含2个确定的N-糖基化位点(aa 69-72、aa 114-117)；功能肽含6个高度保守半胱氨酸位点，形成3个二硫键(aa 136↔201、aa 179↔229、aa 189↔231)，构成“半胱氨酸结”模序。UniProtKB/Swiss-Prot分析亚细胞定位，hβ-NGF主要位于细胞外，少量存于胞质的胞吞内体和高尔基体，三者置信度均为最高值5(见图2)。

3 讨论

WHO报道我国已经成为世界上AD患者最多的国家，严重威胁国人健康[3]。AD目前无有效治疗方法，hβ-NGF基因治疗已成为重要研究方向[4]。然而受制于国内临床技术和伦理限制，目前无法对重组hβ-NGF编码蛋白在患者活体脑组织及细胞中进行动态示踪，限制了基因治疗的疗效评价和临床应用。本实验成功将含EGFP标签的hβ-NGF基因转染至经前人证实[5]能够稳定、高效表达的HEK293 真核细胞系中，荧光显微镜观察到EGFP+hβ-NGF融合蛋白只少部分存于细胞质中，不存在于细胞核内。为印证这一结果，又从生物信息学角度分析亚细胞定位，发现该蛋白大部分位于细胞外，少部分位于细胞内的胞吞内体和高尔基体，进而得出一致性结论。

图2 hβ-NGF蛋白亚细胞定位预测

具有完整分泌活性hβ-NGF氨基酸序列是由信号肽、前导肽及功能肽组成，即hβ-NGF前体原(pre-pro-hβ-NGF)[6]。其合成起始于内质网上的核糖体，信号肽被剪切并引导新生肽链向内质网腔内聚集，经内质网-高尔基体途径，在分子伴侣协助下正确折叠和修饰(形成二硫键和N-糖基化等)，形成hβ-NGF前体(pro-hβ-NGF)非共价二聚体[7]，部分pro-hβ-NGF经切割加工为功能肽，即成熟 hβ-NGF同源二聚体[8]。pro-hβ-NGF/ hβ-NGF二聚体被胞吐至胞外，以自分泌或旁分泌的方式与靶细胞膜表面不同亲和力受体p75NTR/TrkA结合[8，9]，激活下游信号传导通路发挥生物学效应，之后配体-受体复合物通过胞吞形成的内体逆向轴浆运输回胞内，或到胞体特定区域发挥生物学功能，或被溶酶体降解，或回到分泌装置循环使用[10]。上述生物过程主要集中在“细胞质↔细胞膜↔细胞外”循环往复，并未涉及细胞核，支持本研究结论。

综上，本研究为后续hβ-NGF基因转移实验合理选择神经系统宿主细胞，并应用于AD临床基因治疗奠定理论和实验基础。

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