硫酸钙-链霉素缓释颗粒在兔体内缓释的实验研究

陈勇忠 卫秀洋 翁少煌 刘永平

[摘要] 目的 觀察硫酸钙-链霉素缓释颗粒在兔体内的缓释效果及安全性评价。 方法 取大白兔 48 只，随机分为两组，每组24只。实验组在胫骨近端骨缺损置入的硫酸钙链霉素颗粒;对照组植入同样重量的链霉素粉剂。高效液相色谱仪（HPLC）测链霉素浓度。于术后1 d、2 d、3 d、1周、2周、4周、6周、8周、10周取静脉血1 mL待检;在孔周围取组织待检。术后2周、6周行肝肾抽血检查及肝、肾脏组织病理切片检查。术后1周、2周、4周、8周行植入部位X射线检查。 结果 实验组中链霉素在周围组织维持9周最低杀细菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC），植入10周尚处于最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。静脉血液中可维持8周MBC，植入9周尚处于MIC。对照组链霉素在周围组织的2周MBC，植入3周处于MIC;链霉素在血液的1周MBC，植入2周处于MIC。两组血液和组织的药物浓度差异均有统计学意义（P<0.05）。肝脏、肾脏功能生化检查、病理切片检查显示安全性良好，无毒性反应，两组肝脏、肾脏功能组间差异均无统计学意义（P>0.05）。X线及病理学检查显示实验组有着良好的成骨性。 结论 硫酸钙-链霉素颗粒在兔子体内缓慢释放，达到缓释效果，对肝肾组织无损伤。

[关键词] 硫酸钙;链霉素;缓释颗粒;抗结核

[中图分类号] R687.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2018）36-0034-04

[Abstract] Objective To observe the sustained release effect and safety evaluation of Calcium-streptomycin sulfate sustained-release granules in rabbits. Methods 48 rabbits were randomly divided into two groups， with 24 rabbits in each group. The experimental group was placed with calcium sulfate streptomycin granules in the proximal humerus bone defect.The control group was implanted with the same weight of streptomycin powder. The streptomycin concentration was measured by high performance liquid chromatography（HPLC）. 1 mL of venous blood was taken at 1 day， 2 days， 3 days， 1 week， 2 weeks， 4 weeks， 6 weeks， 8 weeks， 10 weeks after surgery for detection. The tissue was taken around the hole for examination. Liver and kidney blood tests and pathological biopsy of liver and kidney were performed at 2 weeks and 6 weaks after operation. X-ray examination of the implant site was performed at 1 week， 2 weeks， 4 weeks， and 8 weeks after surgery. Results Streptomycin in the experimental group maintained a minimum bactericidal concentration（MBC） for 9 weeks in the surrounding tissues， and was still at minimally inhibitory concentration（MIC） at 10 weeks after implantation. It could maintain a MBC for 8 weeks in venous blood and MIC at 9 weeks after implantation. Streptomycin in the control group maintained a minimum bactericidal concentration（MBC） for 2 weeks in the surrounding tissues， and was still at minimally inhibitory concentration （MIC） at 3 weeks after implantation. It could maintain a MBC for 1 week in venous blood and MIC at 2 weeks after implantation. There were significant differences in the drug concentrations of blood and tissue between the two groups（P<0.05）. Liver and kidney function biochemical examination and pathological biopsy showed good safety and no toxicity. There was no significant difference between the two groups in liver and kidney function between two groups（P>0.05）. X-ray and pathological examination showed that the experimental group had good osteogenicity. Conclusion Calcium-streptomycin sulfate particles are slowly released in rabbits， which can achieve sustained release effect and has no damage to liver and kidney tissues

[Key words] Calcium sulfate; Streptomycin; Sustained release granules; Anti-tuberculosis

链霉素作为一线抗结核药物之一，但是不能口服给药，临床常肌肉注射，连续肌肉注射长达3个月，患者难以坚持，注射部位感染、硬结、肌肉挛缩，长期使用可导致肾毒性和耳毒性。若在清除结核病灶后直接在创面撒上链霉素粉剂，有效药物浓度维持时间不够长;如果病灶内一次给予过量的药物，虽然可以提高药物在局部浓度和有效作用时间，但其不良反应的发生率高。局部药物缓释系统，是一种理想的给药方式[1-5]。医用硫酸钙不仅作为药物载体而且作为填充骨缺损的修复材料已在临床上应用[6-7]。本研究硫酸钙-链霉素制造成缓释系统颗粒植入兔子内体，观察周围肌肉组织、血液药物浓度、肝脏、肾脏组织病理学研究，为临床治疗骨结核提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物选用新西兰大白兔48只（6月龄，雌雄不拘），体重2.5 kg左右（福建医科大学动物实验中心提供）。注射用硫酸链霉素（山东鲁抗医药股份有限公司，规格1 g/瓶，国药准字H37020187）;医用硫酸钙（英国百赛公司，5cc思迪骨粉）。

1.2 硫酸钙-链霉素缓释颗粒制作

以1 g链霉素注射粉剂与5 cc医用硫酸钙粉剂，全部倒入无菌混料碗中，预先搅拌混匀后倒入2 mL配套的混合液灭菌注射用水;充分搅拌直至均匀的膏糊状（大约需30 s）。在提供的3 mm×3 mm圆柱状的模具中均匀涂抹一层膏糊。确保每个颗粒孔穴均被填充满;填充时用20N的压力（或用2 kg砝码）加压驱赶残存的空气;让膏糊在模具内至少停留15 min固化;伸缩模具释放颗粒。硫酸钙-链霉素颗粒电子显微镜下显示：结构以棒状结构为主，硫酸钙宽度为7.5～10.0 μm，长40～50.0 μm，链霉素为颗粒形状为主5 μm×5 μm×5 μm。

1.3 分组及模型制作

48只新西兰兔，随机分为两组，实验组硫酸钙-链霉素颗粒、对照组链霉素，每组各24只。

实验用兔置于固定架中，使用地西泮（1 mg/kg）经耳源静脉注射麻醉。待兔完全麻醉，仰卧位固定于手术台。单侧下肢胫骨上段手术区备皮，酒精和碘伏消毒后铺巾。以胫骨近端内侧为中心做纵行切口，长约3 cm。依次切开皮肤、皮下，从肌间隙进入至胫骨内侧，剥离骨膜。以胫骨近端处为中心，用电钻开槽并逐渐扩孔至长10 mm，宽6 mm圆柱形骨缺损，生理盐水冲洗创口。A组孔内置入灭菌的颗粒4颗，含链霉素约12 mg，共48 mg。对照组植入同样份量的链霉素。缝合筋膜包裹骨骼创面，缝合皮肤。放回笼内饲养并观察。术后肌注头孢唑啉钠250 mg，连续3 d。

1.4 观察指标

1.4.1 血药及组织浓度检测  于术后1 d、2 d、3 d、1周、2周、4周、6周、8周、10周，取对侧耳缘静脉血1～2 mL待检;在孔半径5 mm处对称取0.5 mg大小组织4块，分别粉碎后加5 mL PBS匀浆，400 r/min离心15 min，留取上清液-20℃冻存待检。高效液相色谱法测定链霉素浓度。

1.4.2 硫酸钙-链霉素缓释系统组织相容性测定  取术后2周、6周实验兔植入部位、肝、肾脏组织，常规制成病理切片，HE染色，光学显微镜观察。取术后2周、6周实验兔的耳缘静脉血、做肝、肾功能检查。

1.4.3 硫酸钙-链霉素缓释系统成骨检测  实验兔术后1周、2周、4周、8周行植入部位X射线检查，了解成骨情况;术后8周实验兔植入部位取材，制成病理切片，光镜检查成骨情况。

1.5 统计学处理

采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，用独立样本t检验进行两组间的比较，计数资料采用频数和百分比表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

兔麻醉清醒后，觅食水正常。实验组死亡2只，对照组死亡1只，为保证数据的准确性，及时补充动物。死亡原因是患肢骨折后导致伤口感染，死亡。其余动物顺利完成本实验，生长平稳，活动尚可，伤口均能达到愈合，未出现排异反应等并发症。

2.2 血药浓度及组织浓度，以及药物代谢曲线

实验组中链霉素在周围组织维持9周MBC，植入10周尚处于MIC。静脉血液中可维持8周MBC，植入9周尚处于MIC。对照组链霉素在周围组织的2周MBC，植入3周处于MIC;血液的1周MBC，植入2周处于MIC。两组血液和组织的药物浓度持续时间差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.3 硫酸钙-链霉素缓释系统组织相容性测定

術后肝肾组织取病理检查提示，术后早期2周、术后晚期6周细胞形态良好，肝肾无器质性改变。

2.4 血肝肾功能检查

肝功能、肾脏功能检查显示2周后动物的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肌酐（CR）、尿素氮（BUN），较正常对照组均无明显升高，差异无统计学意义（P>0.05）。6周后动物的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肌酐（CR）、尿素氮（BUN），较正常对照组均无明显升高，差异无统计学意义（P>0.05）。术前与术后实验组谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肌酐（CR）、尿素氮（BUN）指标均无明显升高，差异均无统计学意义（P>0.05）。

2.5 硫酸钙-链霉素缓释系统成骨检测

实验兔术后1周、2周、4周、8周行植入部位X射线检查，颗粒逐渐缓释，消失。局部出现诱导成骨。术后8周实验兔植入部位取材，制成病理切片，可见骨细胞长入，内含毛细血管、中性粒细胞。

3 讨论

骨结核好发于脊柱、股骨远端、胫骨近端及膝关节。如果诊治不及时或不规范，极易造成关节毁损或椎体破坏、甚至累及椎管，压迫脊髓神经，造成瘫痪[8-9]。脊柱椎体的上下椎板、股骨远端、胫骨近端等部位主要由骨细胞软骨细胞、致密胶原及糖蛋白基质共同构成，自身修复困难。同时病灶周围坏死硬化的骨具有屏障作用，导致局部药物浓度过低或者不能达到病灶[10-11]。因此在治疗脊柱、关节骨结核时，不仅要规范地抗结核，维持局部有效血药浓度，还要解决局部病灶成骨、修复的问题。

病灶局部搭载含链霉素缓释药物人工骨支架植入是当前理想的解决策略[12-13]。医用硫酸钙是一种良好的骨修复填充材料，广泛应用于口腔科和矫形外科[14-15]。文献报道，硫酸钙具备诸多理想的骨移植替代材料的特点：①能在生物体内完全吸收;②较好的生物相容性、可成形性，植入后能与原骨组织形成生理结合;③为新骨生长提供支架，填补骨缺损，防止周围软组织快速长入;降解后提供大量的钙离子，刺激成骨细胞活性，诱导成骨;④灭菌方便且自然界中蕴含量丰富。近几年来，曾尝试将链霉素和硫酸钙做成缓释系统应用于脊柱结核的治疗，取得了预期的疗效[16-17]。

根据实验结果显示，硫酸钙-链霉素缓释系统颗粒在兔子胫骨实验药物代谢曲线显示，组织内的链霉素可在体内持续释放，能够维持局部有效治疗的药物浓度。链霉素可维持高于10倍结核分枝杆菌MIC，长达10周。文献报道抗结核药物一般最低杀菌浓度MBC为最低抑菌浓度MIC的10倍。链霉素的MIC为0.05 μg/mL。该颗粒在动物体内2周左右出现崩解，药物累计释放量突然增加，药物浓度达到高峰，而后逐渐降低，表明存在突释现象。药物的突释也是药物工作者共同存在的问题。资料显示，药物突释的定义3 d内释放量比例不超过总量的40%[18]。本缓释颗粒3 d时累计释放量30%，在药物突释的范围内。同时电镜下结构显示，链霉素与硫酸钙棒状的分子结构，分子间相互交错成形，达到后续的缓慢释放作用。

文献表明，当血药浓度达到50 μg/mL以上时不良反应增加，肝毒性、肾毒性可能出现。从实验的血药浓度数据显示，血药浓度相对平稳，虽然出现峰值，突释现象存在，但是峰值及维持的血药浓度均低于50 μg/mL。故该实验安全性评价良好。同时实验组在9周内均可检测到高于10倍×结核分枝杆菌MIC。已经达到抗结核治疗的目的。从实验药物代谢曲线的数据可以得出，局部组织的药物浓度均高于同期的血液药物浓度，且能够长时间地维持结核分枝杆菌MIC。从药物浓度代谢曲线也可证实，组织药物出现峰值在2周左右，血药浓度稍迟于组织浓度出现峰值，在3周左右。说明链霉素是先通过组织，再吸收后入血液的，血液内的峰值出现时间要迟于组织浓度峰值出現时间。避免了局部的药物浓度较低，产生耐药现象。同时血液药物浓度不至于过高，导致不良反应。在这点上是链霉素区别于其他抗结核药物，链霉素是原型的发挥抗结核作用，可以不通过血液吸收起作用。

从药物的安全性数据显示，在实验的术后早期2周时、与术后晚期6周的肝肾组织病理学检查，肝肾组织细胞形态正常，均无器质性改变，提示无明显的肝脏，肾脏组织损伤。通过肝肾功能检查分析，谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肌酐（CR）、尿素氮（BUN）指标均无明显升高，统计学无显著差异（P>0.05）。说明该血药浓度并未产生不良反应，无急性、慢性肝肾功能损伤，用药的安全性良好。

从术后影像学检查显示，术后1周颗粒清晰可见。术后2周左右颗粒开始模糊，提示开始出现崩解。术后4周时颗粒已经变得完全模糊，成云雾状，提示时期颗粒已经完全崩解成细微颗粒。术后8周时颗粒已经消失，出血骨痂逐渐形成。提示硫酸钙已经开始诱导成骨。峰值的出现也是在颗粒崩解过程中与大量释放链霉素相关。术后病理检查提示：骨缺损处发生炎症反应，见炎症细胞、中性粒细胞长入、浸润，毛细血管增殖。成骨细胞快速分化，逐渐形成新骨骨痂。研究认为，原理可能是硫酸钙刺激了周围组织的生长，包括毛细血管及细胞间质组织的长入，同时成骨细胞附着于硫酸钙的表面，并向植骨材料内部逐渐爬行成骨。

本研究通过将硫酸钙-链霉素缓释系统颗粒植入兔子胫骨实验显示，药物代谢能够保证有效浓度的情况下，从病理学检查上对肝肾组织的毒性反应影响小，肾功能、肝功能检查提示无肝肾毒性。本研究仍然存在不足，如药物存在一定的突释现象，缓释颗粒的强度不够，容易破碎，下一步解决方案将在后续研究中进一步改进。

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（收稿日期：2018-09-20）