龟鹿二仙胶通过调控PD-1表达抑制H22荷瘤小鼠肿瘤生长的研究

钟亚珍 林贤雷 陆金华 林胜友

[摘要] 目的 初步探讨龟鹿二仙胶通过降低肿瘤周围T淋巴细胞PD-1表达，抑制T细胞凋亡，从而抑制肿瘤生长的分子机制。 方法 采用皮下接种H22肝癌细胞株方法建立荷瘤小鼠模型，观察藥物干预后各组荷瘤小鼠肿瘤的生长速度，Annexin V/PI双染色法测定小鼠脾脏T淋巴细胞凋亡比例，分离肿瘤浸润性T淋巴细胞，流式细胞检测PD-1阳性细胞的比例。 结果 （1）龟鹿二仙胶呈剂量依赖抑制皮下瘤的生长，顺铂组及高、中、低剂量组抑瘤率分别为81.36%、79.64%、48.86%、21.96%;（2）顺铂组及高、中、低剂量组小鼠T淋巴细胞凋亡比例分别为早期（24.37±0.32）%、（5.30±0.21）%、（6.90±0.16）%、（11.93±2.01）%;晚期（8.83±1.23）%、（4.73±0.33）%、（6.40±0.34）%、（7.47±0.54）%，说明与顺铂组比较，龟鹿二仙胶能够抑制小鼠T淋巴细胞凋亡;（3）龟鹿二仙胶高剂量组、中剂量组的PD-1表达阳性细胞比分别为（11.73±0.54）%、（20.00±0.66）%，明显低于生理盐水组（32.57±0.65）%和顺铂组（31.83±0.43）%，说明龟鹿二仙胶能够降低肿瘤浸润T淋巴细胞中PD-1阳性的比例。 结论 龟鹿二仙胶具有抑制肿瘤生长的作用，其机制可能是通过抑制PD-1表达，减少T淋巴细胞凋亡，增强机体免疫力，从而抑制和杀伤肿瘤细胞得以实现的。

[关键词] 龟鹿二仙胶;T淋巴细胞;PD-1;凋亡

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2018）36-0001-05

[Abstract] Objective To investigate the molecular mechanism of Guilu Erxianjiao in inhibiting tumor growth and inhibiting T cell apoptosis by reducing the expression of PD-1 in T lymphocytes around the tumor. Methods The tumor-bearing mouse model was established by subcutaneous inoculation of H22 hepatoma cell line. The growth rate of tumor-bearing mice in each group was observed after drug intervention. Annexin V/PI double staining was used to detect the percentage of apoptosis of mouse spleen T lymphocytes. Tumor infiltrating T lymphocytes were isolated. The proportion of PD-1 positive cells was detected by flow cytometry. Results （1）Guilu Erxianjiao inhibited the growth of subcutaneous tumors in a dose-dependent manner. The tumor inhibition rate of cisplatin group and high， medium and low dose groups was 81.36%， 79.64%， 48.86% and 21.96%， respectively. （2）The percentages of T lymphocyte apoptosis in the cisplatin group， high， medium and low dose groups were early （24.37±0.32）%， （5.30±0.21）%， （6.90±0.16）%， （11.93±2.01）%， and late （8.83±1.23）%， （4.73±0.33）%， （6.40±0.34）%， （7.47±0.54）%， indicating that compared with cisplatin group， Guilu Erxianjiao could inhibit the apoptosis of mouse T lymphocytes. （3）The ratio of PD-1 positive cells in Guilu Erxianjiao high dose group and medium dose group of was（11.73±0.54）% and （20.00±0.66）%， which was significantly lower than that in the saline group （32.57±0.65）% and cisplatin group （31.83±0.43）%， indicating that Guilu Erxianjiao could reduce the proportion of PD-1 positive in tumor infiltrating T lymphocytes. Conclusion Guilu Erxianjiao has the effect of inhibiting tumor growth. This may be achieved by inhibiting PD-1 expression， reducing T lymphocyte apoptosis， enhancing immunity to inhibit and kill tumor cell.

[Key words] Guilu Erxianjiao; T lymphocytes; PD-1; Apoptosis

近年来，随着对肿瘤免疫逃逸机制的深入了解，通过阻断程序性死亡蛋白1（programmed cell death 1，PD-1）及其配体1（PD-1 ligand，PD-L1）构成的PD-1/PD-L1通路、重新激活机体免疫系统对肿瘤的杀伤作用成为了一种新的肿瘤治疗策略[1-2]。PD-1/PD-L1抑制剂目前适用于多种类型肿瘤，但总体治疗人群有效率在20%左右[3]，双抗以及和放化疗、抗血管治疗药物的联合治疗一定程度提高了肿瘤治疗反应率，但也伴有较高的副作用，与此同时，获得性耐药也是目前免疫治疗的难点。

课题组前期基础研究发现龟鹿二仙胶可以有效抑制化疗小鼠脾脏T淋巴细胞凋亡，对患者的免疫功能具有一定的保护作用[4]，进一步研究龟鹿二仙胶的免疫调节作用，本研究通过建立荷瘤小鼠模型，观察化疗及中药治疗后小鼠T淋巴细胞凋亡情况及肿瘤浸润性T淋巴细胞中PD-1阳性细胞的比例，初步探讨其可能的抗肿瘤效应。

1 资料与方法

1.1 一般资料

6～8周龄健康的SPF级近交系小鼠（从上海西普尔-必凯实验动物有限公司购得），生产许可证号：SCXK（*）2012-0002，饲养环境：温度为18℃～29℃，日温差≤3℃，相对湿度达40%～70%，昼夜明暗交替。

1.2 药物和细胞株

按龟板胶6 g、鹿角胶9 g、枸杞子15 g、生晒参9 g比例组成复方，中药饮片由杭州市肿瘤医院中药房采购，委托浙江中医药大学中药研究所制剂，根据“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表”计算等效剂量方法，煎汁，过滤，浓缩至100%浓度，使每毫升含生药1 g，分装，置4℃冰箱备用。顺铂粉剂购自杭州市肿瘤医院药房（批号：1WA2A160100）。H22肝癌細胞购自中科上海细胞库。

1.3 试剂

青链霉素混合液（100X）购自Solarbio公司（货号：P1400-100）;淋巴细胞分离液购自CEDARLANE公司（货号：CL5020）;胎牛血清购自GIBCO公司（货号：16000-044）;RMPI-1640购自Hyclone公司（货号：SH30809.01B）;Anti-PD1 antibody 购自Abcam公司（货号：ab95791）;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司（货号：C1062）。

1.4 主要仪器

离心机为上海卢湘仪离心机仪器有限公司产品，显微镜为上海蔡康光学仪器有限公司产品，CO2恒温培养箱为Thermo产品，流式细胞仪为BD产品。

1.5 细胞培养

H22肝癌细胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI1640 培养液中，置于37℃、5%CO2 浓度和100% 湿度的CO2培养箱中培养。

1.6 建立荷瘤小鼠模型

选用正常传代的H22肝癌细胞，接种于小鼠腹腔，无菌取腹水，用PBS稀释成肿瘤细胞悬液，离心收集细胞，待腹水生成后抽取腹水，调整细胞浓度为1.5×107个/mL。将H22细胞200 μL（3×106个）接种于小鼠腋部皮下，大约1～2周后成瘤。

1.7分组及药物给药

实验分为阴性对照组（生理盐水组）、化疗对照组（顺铂组）、龟鹿二仙胶高剂量组、龟鹿二仙胶中剂量组、龟鹿二仙胶低剂量组共5组，每组3只。

药物干预方式：阴性对照组腹腔注射生理盐水（0.2 mL），化疗对照组腹腔注射顺铂3 mg/（kg·d），两组均灌胃生理盐水0.3 mL;龟鹿二仙胶高剂量组、中剂量组、低剂量组灌胃龟鹿二仙胶剂量（分别为0.38 g、0.19 g、0.095 g）：各剂量组均腹腔注射生理盐水0.2 mL，连续给药9 d（d1～d9）。

1.8 计算荷瘤小鼠抑瘤率

最后一次干预后24 h将小鼠脱颈椎处死，剖取腋部皮下肿瘤组织称重，分别计算加药组的肿瘤抑制率。公式为：肿瘤抑制率（%）=（模型组平均瘤重-药物干预组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%。

1.9 流式细胞术检测药物对细胞凋亡率的影响

脾切除后，用PBS漂洗2～3次，于5 mL离心管中剪成碎泥状后过细胞筛，PBS冲洗2～3次，收集滤液。离心后收集单核细胞层并用PBS洗涤3次，PBS重悬制备成1×108个/mL单核细胞悬液。每100 μL细胞加入20 μL CD3+磁珠抗体，4℃孵育15 min后buffer（PBS、0.5% FBS）洗涤2次，用500 μL buffer重悬细胞（细胞数≤108），并于磁场中分选（4℃）。润洗，将细胞悬液过柱，收集未被磁性标记的细胞，重复操作2次，所收集细胞即为CD3-T淋巴细胞。PBS洗涤2次后重悬备用。取（5～10）×104重悬的细胞，离心，弃上清，加入195 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC，混匀。避光孵育10 min。离心，弃上清，加入190 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞后加入10 μL碘化丙啶染色液，混匀，冰浴避光放置。随即进行流式细胞仪检测。

1.10流式检测肿瘤浸润T淋巴细胞中PD-1表达阳性的比例

处死小鼠无菌条件下取得瘤体标本，除去黄色脂肪组织及血块置于PBS缓冲液中浸泡5 min，充分剪碎，研磨制成单细胞悬液，经小鼠淋巴细胞分离液梯度离心后收集白膜层，培养基重悬，置入250 mL培养瓶，37℃、5% CO2培养箱贴壁2 h。收集未贴壁细胞，其中即含有肿瘤浸润性T淋巴细胞，PBS洗涤3次，重悬细胞后制备成单细胞悬液，之后1000 rpm离心10 min，弃上清，沉淀用100 μL PBS重悬，使用抗小鼠PD-1抗体 4℃ 30 min染色后上机检测。

1.11 统计学分析

采用SPSS22.0统计软件包分析实验数据，计量资料用（x±s）表示，组内比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 龟鹿二仙胶能够抑制肿瘤生长

实验表明，龟鹿二仙胶具有抑制肿瘤生长的作用，呈剂量依赖关系。结果显示顺铂和高中低剂量处理组抑瘤率分别为81.36%、79.64%、48.86%、21.96%，与空白对照组相比均有统计学意义（F=165.31，P=0.013），其中顺铂组、龟鹿二仙胶高、中剂量组与生理盐水组相比具有显著抑制肿瘤的作用（F=218.24，P=0.008）。

2.2 龜鹿二仙胶能够抑制荷瘤小鼠T淋巴细胞凋亡

Annexin V-FITC/PI双染法分析显示：与顺铂组比较，龟鹿二仙胶各剂量组小鼠T淋巴细胞早期凋亡比均减少，差异具有统计学意义（F=158.41，P=0.011），高中剂量组小鼠T淋巴细胞晚期凋亡比减少（F=156.63，P=0.018），说明龟鹿二仙胶能够抑制荷瘤小鼠T淋巴细胞凋亡，且抑制作用与剂量呈正相关。

2.3 龟鹿二仙胶能够降低肿瘤浸润T淋巴细胞中PD-1阳性的比例

与生理盐水和顺铂组比较，龟鹿二仙胶高、中剂量组的PD-1表达阳性细胞比明显降低，差异有统计学意义（F=2.08，t=18.91，P=0.014;F=1.83，t=18.37，P=0.015;F=1.76，t=17.64，P=0.016;F=1.71，t=16.93，P=0.017），且龟鹿二仙胶呈剂量依赖的方式抑制PD-1阳性T细胞的表达;生理盐水组和顺铂组间比较PD-1表达阳性细胞比无显著统计学差异（P<0.05），说明顺铂的抗肿瘤作用与调节T细胞PD-1表达不相关。

3 讨论

肿瘤免疫治疗是通过调动机体的免疫系统，增强抗肿瘤免疫力，从而抑制和杀伤肿瘤细胞，以PD-1抗体、PD-L1抗体为代表的免疫检查点抑制剂是目前临床研究的热点。程序性死亡受体1（programmed cell death-1，PD-1）存在PD-L1（B7-H1）和PD-L2（B7-DC）两个配体，可与T细胞表面受体PD-1结合，在免疫应答反应中起重要的负调节作用[5]。PD-1是一种重要的免疫检查点，可广泛表达于多种细胞，例如B细胞、T细胞以及NK/T细胞等[6-8]，肿瘤细胞表面往往具有异常高表达的PD-L1分子，与肿瘤浸润T淋巴细胞表面的PD-1分子结合，在肿瘤微环境中抑制T细胞活化的免疫应答，避免肿瘤细胞被T细胞杀伤，最终实现肿瘤的免疫逃逸[9-10]。而抗PD-1或PD-L1抗体能够阻断肿瘤表面PD-L1和T细胞表面PD-1的结合，消除这一免疫抑制效应，使得T细胞重新被激活，识别并杀伤癌细胞[11-13]。在肿瘤部位，抗PD-1抗体还可以结合巨噬细胞表面的Fcγ受体，介导调节性T细胞的消耗，从而上调T细胞的比例，增强抗肿瘤能力[14]。

现代药理表明，益气养阴类中药具有免疫调节作用[15-17]。龟鹿二仙胶为中医传统古方，该方由鹿角胶、龟板、人参、枸杞子四味药物组成，《医方考》、《古今名医方论》认为其具有大补元气、益精生血、阴阳并补之效。相关实验结果表明龟鹿二仙胶具有提高细胞免疫的作用，陈萍等[18]研究发现，龟鹿二仙胶联合激素替代周期治疗能够提高卵巢早衰患者外周血中的CD3+T细胞、CD4+T细胞水平，从而提高患者免疫功能、改善患者临床症状。钱钧等[19]研究发现龟鹿二仙汤能有效升高 CD4+，降低 CD8+，从而提高 CD4+/CD8+的比值，使免疫功能对机体抗肿瘤作用处于更有利的状态。师林等[20]实验结果表明用加味龟鹿二仙胶汤合用化疗不仅可以缩小肿瘤病灶，还能够调节细胞免疫功能。

结合以上，课题组提出龟鹿二仙胶可以通过恢复T细胞活性发挥抗肿瘤效应的假说。实验结果显示：龟鹿二仙胶以剂量依赖的方式抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长;同时给予龟鹿二仙胶处理后荷瘤小鼠脾脏T淋巴细胞凋亡减少，这种抑制作用具有剂量依赖性，尤其是当T淋巴细胞处于凋亡晚期时，高剂量组仍具有抑制作用。同时研究还发现，龟鹿二仙胶中、高剂量可以降低肿瘤浸润T淋巴细胞中PD-1阳性的比例。

综上所述，本研究初步显示龟鹿二仙胶具有抑制肿瘤生长的作用，其机制可能是通过抑制PD-1表达，减少T淋巴细胞凋亡，恢复T细胞活性实现的，由于肿瘤免疫的过程复杂，多种机制的共同作用影响了免疫检查点药物的疗效，具体的内在机制有待于进一步深入研究。

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（收稿日期：2018-06-22）