超高效液相色谱-串联质谱法测定食品中碱性嫩黄O的含量

◎ 夏莉娟，冯秀娟

（1.宁夏回族自治区食品药品审评查验中心，宁夏 银川 750001；2.宁夏回族自治区食品检测研究院，宁夏 银川 750001）

碱性嫩黄O，又称奥拉明O，呈黄色粉末状，是一种工业染料，主要用于醋纤、棉织品的染色，还可用于纸张、皮革、油漆等的着色，一般接触或者吸入都会引起中毒。GB 2760-2014《食品添加剂使用标准》[1]规定，严禁将碱性嫩黄O作为食品添加剂使用，但一些不法商贩为使腐竹、豆皮的色泽光亮，把碱性嫩黄O非法加入到豆制品中（如腐竹、豆皮、豆干等），严重危害了广大消费者的身体健康[2]。目前，对食品中碱性嫩黄O的检测方法有高效液相色谱法[3-8]、高效液相色谱-串联质谱法[9]，相关标准有DB33/T 703-2008《食品和农产品中多种碱性工业染料的测定 液相色谱-串联质谱法》[10]和DBS 22/006-2012《食品中酸性橙、碱性橙2和碱性嫩黄的测定 液相色谱-串联质谱法》[11]。食品中碱性嫩黄O检测时往往受到其他组分的干扰，一般需要采用梯度洗脱，有的食品基质中其他组分的干扰较多，在前处理过程中需要净化。目前建立的许多液相色谱-串联质谱法都未经净化处理，很大程度上影响了检测效果。本方法优化了样品处理方式，引入GPC净化系统，建立了测定食品中碱性嫩黄O的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测方法并对市场上的部分豆制品样品进行抽检，以确定建立的UPLC-MS/MS检测方法的实际应用价值。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

①样品。样品为市场随机抽查的各类豆制品，包括豆干、豆腐、豆皮、腐竹、油皮。②仪器。安捷伦液相色谱串联四级杆质谱仪(安捷伦公司出品)、离心机、电子天平、凝胶色谱仪、旋转蒸发仪。③试剂。甲醇（AR，国外进口）、甲酸（色谱纯）、环己烷（AR）、乙酸乙酯（AR），所用试剂除特别标注外均为分析纯试剂，水为超纯水。④定溶液。0.1%甲酸甲醇溶液+0.1%甲酸水溶液=70+30（V/V）。⑤标准物质。碱性嫩黄O标准物质。

1.2 检测方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Ecipse-C18，3.5 μm，2.1×100 mm；柱温：30 ℃；流动相：0.1%甲酸水溶液∶0.1%甲酸甲醇溶液=30∶70；流速：0.2 mL·min-1；进样量：10 μL。流动相梯度洗脱情况见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱条件表

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；扫描方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：4 000 V；雾化器压力：10 L·min-1；离子源温度：350 ℃。质谱分析参数见表2。

表2 碱性嫩黄O的监测离子对表

1.2.3 标准使用液的配制

准确称取碱性嫩黄O标准物质，用定溶液配制成100μg·mL-1的标准储备溶液。临用前，用定溶液根据需要稀释配制成适当浓度的系列标准使用液，分别为2.50、5.00、10.00、20.00、50.00 ng·mL-1和 100.00 ng·mL-1。

1.2.4 样品的处理

1.2.4.1 提取

称取200 g样品，破碎均匀，然后称取1.00 g样品置于10 mL具塞玻璃离心管中，加入（1+1）乙酸乙酯：环己烷溶解，定容至10.0 mL，涡旋混合1 min，超声提取 10 min，4 000 r·min-1离心 5 min。

1.2.4.2 净化

凝胶色谱条件：凝胶净化柱，流动相为乙酸乙酯∶环己烷（1∶1），流速3.5 mL·min-1，5 mL定量环，预淋洗20 min，凝胶色谱平衡8 min，8～18 min收集。吸取5.0 mL离心上清液（1.2.4.1）过GPC柱进行净化。将收集的洗脱液旋转至干。加入1.0 mL定溶液定容。0.22 μm膜过滤，上机测定。

1.2.5 计算公式

样品中碱性嫩黄O的含量X按公式（1）计算：

式中，X-试样中待测组分含量，单位为μg·kg-1；C-待测液中碱性嫩黄O的浓度，单位为ng·mL-1；C0-空白待测液中碱性嫩黄O的浓度，单位为ng·mL-1；V-样品测试样的最后定容体积，单位mL；m-样品质量，单位为g。

2 检验结果

2.1 定性与定量

（1）定性。采用保留时间及相对离子丰度的最大允许偏差来定性，见表3。样品谱图中定性离子的相对丰度与浓度接近的标准品谱图中定性离子的相对丰度进行比较，偏差若在表3允许的偏差范围内，则可判定该待测物为目标物。

表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差表

（2）定量。将标准溶液及样品同时上机，进样量为10 μL，采用外标法定量。其中，定量离子对（m/z）268.2/147.1用来定量，定性离子对（m/z）268.2/252.1辅助定性。标准溶液的质谱图及MRM谱图见图1～2，样品的质谱图见图3。

图1 碱性嫩黄O标准品质谱图

图2 碱性嫩黄O标准品MRM谱图

图3 豆腐样品质谱图

2.2 方法的线性范围及检出限

在优化的条件下，测定配制的2.50、5.00、10.00、20.00、50.00 ng·mL-1和 100.00 ng·mL-1系 列 浓度的碱性嫩黄O标准使用液，标准曲线如图4所示。由图4可知，其峰面积呈现良好的线性关系，回归方程为Y=3891.17X-2210.36，相关系数达0.999 4，重现性好，灵敏度高，仪器的检测限为0.25 ng·mL-1，方法的检出限为 0.5 μg·kg-1。经测试，含量为 0.5 μg·kg-1时的色谱峰信噪比S/N＞3。

图4 碱性嫩黄O标准曲线图

2.3 回收率及精密度试验

2.3.1 精密度实验

将配制的20 ng·mL-1碱性嫩黄O标准溶液连续反复进样6次（n=6），结果表明碱性嫩黄O含量RSD为1.2%，说明在该质谱条件下实验设备具有良好的可靠性。

2.3.2 不同样品在同一加标水平的回收率

随机选取不同样品统一加入1.0 mL 100 ng·mL-1的标准溶液进行加标试验，样品平行测定6次，同时做空白样试验，检测其本底成分，结果见表4。由表4可知：样品中均含有不同量的本底值，扣除空白后，样品本身含量为零。回收率范围为78.6%～115.3%、RSD值在8.0%～9.7%，说明基质对检测结果的影响很小，方法重现性好，准确可靠。

表4 碱性嫩黄O的回收率及精密度试验表

2.3.3 同一样品在不同加标水平的回收率

取1.0 g空白样品（豆腐）添加碱性嫩黄O标准溶液，其浓度依次为 10.0、20.0、50.0 ng·mL-1，每个添加量平行6份，进行加标回收率实验，回收率、相对标准偏差如表5所示。

表5 豆腐中碱性嫩黄O的回收率及相对标准偏差表

2.4 实际样品测定

采用1.2的方法对市售的豆干、豆腐、豆皮、腐竹和油皮豆制品，共25份样品中的碱性嫩黄O进行了检测，结果所有样品均未检出碱性嫩黄O。

3 结论

本试验建立了测定食品中碱性嫩黄O的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测方法。该方法前处理采用GPC进行净化，能够很好的净化和富集样品并解放劳动力，大大提高工作效率。该方法操作简便、灵敏度高、准确性和重现性好，仪器检测限为0.25 ng·mL-1，方法的检出限为0.5 μg·kg-1（S/N＞3），可作为食品安全检测中检测碱性嫩黄O的快速有效检测方法。