脊髓5-HT受体参与电针内关穴对大鼠心脏伤害性感受的调控*

韩 曼 , 刘晓华 , 杜剑青

(1. 陕西中医药大学生理学教研室, 咸阳 712046； 2. 西安交通大学医学部生理学与病理生理学系, 陕西 西安 710061)

心绞痛是冠状动脉供血不足、心肌急剧暂时缺血缺氧所引起的以发作性胸痛或胸部不适为主要表现的临床综合征，是反映心肌已受到损伤并危及生命的重要警示信号。许多病人在经历过心绞痛后会引发胸痛后遗症，如续发的纤维肌痛，并伴有肌肉紧张性的增加，给患者带来极大的身体痛苦[1]。临床和实验研究已经证明电针内关穴能够改善心肌缺血及再灌注发生后的心功能，但这些实验研究大都关注针刺对局部心肌组织改善、心血管活性物质、心肌能量代谢与离子通道影响等方面[2-5]，针刺对心绞痛的镇痛效果及其中枢调控机制的实验研究甚少。动物虽无心绞痛的主观体验，可是存在与其类似的心脏伤害性感受反应。2001年，Jou及他的同事通过心包内注射致痛物质建立了与冠状动脉结扎相似的心脏伤害性感受动物模型，该模型以背斜方肌肌电(electromyogram, EMG)为痛反应的观测指标[6]。本实验室在此模型基础之上，对心脏伤害性感受的中枢调控机制研究已取得初步进展[7,8]。

5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)是中枢神经系统内参与痛觉信息调控的主要神经递质[9,10]，针刺效应与中枢5-HT有着密切的联系，研究表明针刺可以促进中缝大核等中枢核团内5-HT的合成、并加速其释放和利用，但也可减弱5-HT的活动[11]。神经科学研究表明中缝大核内5-HT能神经元发出下行纤维投射至脊髓背角。那么，电针(electroacupuncture，EA)内关穴对心脏伤害性感受是否具有调控作用？脊髓水平的5-HT受体是否参与其中？麦角新碱作为5-HT1和5-HT2受体的拮抗剂被广泛使用。因此，本研究通过电针内关穴联合鞘内注射麦角新碱及其溶媒，观察大鼠心包内注射缓激肽(bradykinin，BK)诱发背斜方肌EMG的变化，探讨电针内关穴对大鼠心脏伤害性感受的镇痛作用及脊髓水平5-HT及其受体在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与实验药品

BL-420A生物信号采集与分析系统(成都泰盟生物科技有限公司)；蠕动泵(BT100-2J，保定兰格恒流泵有限责任公司)；小动物呼吸机(DW3000-B型，淮北正华生物仪器设备有限公司)；韩式穴位神经刺激仪(LH202H，北京华运安特科技有限责任公司)。

戊巴比妥钠、BK、麦角新碱均购于美国Sigma公司。麦角新碱溶于30%二甲基亚砜中，配置成5 μg/l；其余药物均溶解于生理盐水中，配制成所需浓度(戊巴比妥钠：20 mg/ml及5 mg/ml；BK：0.001 mg/ml)。

1.2 实验动物分组

实验选用40只雄性SD大鼠，体质量280～300 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，大鼠在标准清洁级环境中饲养。动物随机分为5组：BK组、BK+EA组、BK+Methysergide组、BK+EA+ Methysergide组、BK+EA+Vehicle组，每组均为8只。各组大鼠均行心包内插管，BK组心包内间隔40 min注射0.2 ml缓激肽共3次；BK+EA组心包内注射0.2 ml BK联合电针双侧内关穴；BK+Methysergide组心包内注射0.2 ml BK联合鞘内注射10 μl Methysergide；BK+EA+Methysergide组心包内注射0.2 ml BK联合电针双侧内关穴结合鞘内注射10 μl Methysergide；BK+EA+Vehicle组心包内注射0.2 ml BK联合电针双侧内关穴结合鞘内注射10 μl Vehicle。

1.3 实验动物模型建立

实验动物给予初始剂量为2%戊巴比妥钠(45～55 mg/kg)腹腔麻醉。气管插管对动物实施人工呼吸(呼吸频率：60～70/min，潮气量：5.0～6.0 ml)，左侧颈静脉插管后连接蠕动泵，0.05%戊巴比妥钠(15 mg/kg·h)维持麻醉，右侧颈总动脉插管，监测平均动脉压处于90～100 mmHg，从而保证一个稳定的麻醉状态。暴露左侧背斜方肌，记录EMG。通过温控仪维持大鼠体温在(37.0±0.5)℃。

背斜方肌EMG的记录：同芯电极插入背斜方肌约1.5～1.7 mm，通过BL-420A生物信号采集与分析系统记录其EMG活动，每次BK诱发EMG活动总放电单位数(total number of motor unit discharges, TMUD)通过BL-420A分析软件直接统计得出。由于不同大鼠BK诱发的TMUD有所不同，为了消除个体之间的差异，每只大鼠首次心包内注射BK所诱发的TMUD，作为基础对照，即为100%；其后续EMG的TMUD均以首次TMUD为分母进行标化，得出百分数，即EMG的变化率。

心包插管术与给药方法：将实验动物左侧第1到第3肋软骨切断，暴露胸腺。沿胸腺中线分离胸腺，暴露心包膜。用玻璃探针的尖端在心包膜上开一小孔，将一内径0.051 cm、外径0.094 cm、长12～14 cm远端有数个小洞的硅胶管顺胸腺中线经此孔插入心包约2 cm，依次缝合各层胸壁组织，以固定心包插管。通过心包插管心包内注射BK 0.2 ml，记录EMG活动60 s后回抽，0.2 ml无菌生理盐水反复冲洗心包5次，同一只大鼠，心包注射BK每次间隔40 min。

1.4 脊髓蛛网膜下腔置管术与药物注射

按照Yaksh介绍的方法行脊髓蛛网膜下腔置管。动物取俯卧位，于两耳尖剪开皮肤，纵向分离肌肉，暴露枕骨大孔。用精细眼科手术剪小心剪开硬脊膜，可见清亮透明的脑脊液迅速涌出。使大鼠的头部向下倾斜，沿脊髓尾侧的方向将一段充满生理盐水长约10 cm PE-10管缓慢从枕骨大孔开口处插入到T3～T5蛛网膜下腔内，将改良过的20 μl微量注射器与PE-10管连接，药物注射体积为10 μl，注射的时间约1 min。每次实验结束后，经PE-10管注入10 μl 2%膀胺天蓝以标记药物的扩散范围，统计注射位置在T3～T5的实验数据。

1.5 电针内关穴

电针选取双侧“内关”穴，定位标准参照《实验针灸学》[12]，“内关”穴位于前肢内侧，腕关节上约3 mm的尺桡骨缝隙间。分别于双侧“内关”穴行毫针直刺2～3 mm，连接韩氏穴位神经刺激仪，选择等幅疏密波进行电针刺激，频率2 Hz/100 Hz，电流强度为2 mA。

1.6 统计学处理

各处理因素干预大鼠心包内注射BK诱发EMG的变化率以均数±标准差表示，应用SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析。组间比较采用One-way ANOVA并LSD检验进行分析，两组间比较采用配对t检验。

2 结果

2.1 心包内注射BK诱发的EMG反应

心包内注射0.2 ml生理盐水背斜方肌无放电，心包内注射0.2 ml BK背斜方肌放电为 2 320 个(标化为100%)，间隔40 min心包内3次注射BK诱发的背斜方肌EMG百分数分别为100%、(99.3±0.7)%、(98.6±0.7)%，3次之间的差异无统计学意义(P>0.05,图1A、B)

Fig.1Intrapericardial BK-evoked EMG responses of the dorsal spinotrapezius muscle

BK： Bradykinin； EMG： Electromyogram

2.2 电针内关穴后心包内注射BK诱发EMG反应的变化

电针双侧内关穴30 min后，心包内注射BK诱发EMG的TMUD为(48.3±0.8)%，与单纯心包内注射BK诱发EMG的TMUD(100%)相比显著减少，差异具有统计学意义(P<0.05,图2A、B)。

Fig.2Changes of EMG responses before and after electroacupuncture at Neiguan point

BK： Bradykinin; EA： Electroacupuncture

*P<0.05vsBK

2.3 鞘内注射麦角新碱后心包内注射BK诱发EMG反应的变化

2%膀胺天蓝标记的药物扩散范围表明，各组大鼠鞘内注射位点均位于T3～T5。鞘内注射麦角新碱10 min后，心包内注射BK诱发EMG的TMUD为(97.7±0.3)%，与单纯心包内注射BK诱发EMG的TMUD(100%)相比有所减少，但差异无统计学意义(P>0.05,图3A)。

2.4 鞘内注射麦角新碱联合电针内关穴后心包内注射BK诱发EMG反应的变化

鞘内注射麦角新碱10 min后，再电针双侧内关穴30 min，心包内注射BK诱发EMG的TMUD为(81.2±0.8)%，与电针双侧内关穴30 min后，心包内注射BK诱发EMG的TMUD(48.0±0.7)%相比，差异具有统计学意义(P<0.05,图3B)。

Fig.3Effect of electroacupuncture at Neiguan on EMG responses before and after intrathecal injection of methysergide or vehicle

BK： Bradykinin; EA： Electroacupuncture

*P<0.05vsBK;#P<0.05vsEA+BK

2.5 鞘内注射溶媒联合电针内关穴后心包内注射BK诱发EMG反应的变化

鞘内注射溶媒10 min后，再电针双侧内关穴30 min，心包内注射BK诱发EMG的TMUD为(50.4±1.1)%，与电针双侧内关穴30 min后，心包内注射BK诱发EMG的TMUD(48.1±1.0)%相比，差异无统计学意义(P>0.05,图3C)。各组大鼠背斜方肌EMG反应见表1。

GroupEMG(%) 123 BK 100.0±0.099.3±0.798.6±0.7BK+EA100.0±0.048.3±0.8∗BK+Methysergide100.0±0.097.7±0.3BK+EA+Methysergide100.0±0.048.0±0.7∗81.2±0.8∗#BK+EA+Vehicl100.0±0.048.1±1.0∗50.4±1.1∗

EMG： Electromyogram; BK： Bradykinin; EA： Electroacupuncture

*P<0.05vs1;#P<0.05vs2

3 讨论

现在已明确，心脏的疼痛主要产生于化学性刺激并非机械性刺激，心肌缺血时BK、5-HT、腺苷和前列腺素等的释放可引发痛觉。Jou及我们前期的研究表明大鼠心包内注射致痛物质(包括BK、辣椒素)，激活伴随心交感神经走行的心感觉传入神经纤维，该纤维进入T3～T5脊髓节段，激活痛反应神经元的活动，继而引起心脏-躯体运动反射，该反射以背斜方肌EMG为观测指标[13-15]。临床研究也证明心脏功能异常能够引起继发性肌肉收缩和/或肌张力增加[16,17]。因此，本研究以背斜肌EMG作为大鼠心脏伤害性感受痛反应指标。结果表明，电针内关穴抑制心包内注射BK诱发的背斜方肌EMG反应，表明电针内关穴能够抑制心脏伤害性感受，这与临床上电针内关穴能够缓解心绞痛病人疼痛的研究结果相一致[3]。

现代神经生物学研究认为针刺镇痛是由于针刺信息激活内源性痛觉调制系统，在各级中枢水平上与伤害性刺激信息相互作用、相互整合，抑制伤害性刺激的传入信息，从而实现镇痛。5-HT是针刺经络腧穴后，信号传入的中枢调控物质之一，在痛觉调控中发挥重要作用[9-11]。脊髓是中枢神经系统的低级中枢，是痛觉信息加工、处理的第一站。电针穴位提高脊髓内5-HT的含量，既可通过突触后抑制方式抑制脊髓后角伤害性神经元活动，也可通过中间神经元的介导来阻断伤害性信息的传递，下调或阻断脊髓水平5-HT受体可能翻转针刺的镇痛效应。然而，5-HT对脊髓伤害性反应的调节是复杂的，可能产生抑制作用，也有可能产生易化作用[18]。这与5-HT激活的受体亚型不同、受体拮抗剂选用不同或者伤害性刺激类型不同有关。

有研究显示脊髓内的5-HT1、5-HT2和5-HT3受体与镇痛效应有关[19,20]。脊髓水平5-HT受体参与针刺镇痛以往重要集中在躯体痛觉的研究[21]，对于内脏痛觉尤其是心脏痛觉的研究甚少,这部分归因于心脏痛觉模型复制困难。本研究在Jou建立的大鼠心脏伤害性感受模型基础之上，鞘内注射5-HT受体拮抗剂—麦角新碱部分翻转电针内关穴对背斜方肌EMG的抑制作用，而鞘内注射溶媒对背斜方肌EMG无影响，提示脊髓水平5-HT和它的受体参与电针内关穴对心脏伤害性感受的抑制调控作用。要想明确5-HT受体何种亚型在电针内关穴对心脏伤害性感受的抑制调控中发挥重要作用，还需借助特异性更高的5-HT受体拮抗剂进行下一步研究。