黄芪甲苷对血管紧张素Ⅱ诱导肾小球系膜细胞增殖及炎症因子表达的影响*

熊 莉， 吕梦娟， 窦德宇， 马玉红△

(1. 皖南医学院诊断教研室， 2. 中心实验室， 芜湖 241001)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy， DN) 是糖尿病的一种慢性并发症，近年来其发病率呈现逐年上升的趋势。针对DN的研究已逐步成为医学研究的热点问题。研究表明，肾内肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS) 尤其是血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，AngⅡ) 在DN的发生发展中有着极其重要的地位[1]。血管紧张素Ⅱ是RAS的主要活性物质，它不仅作为一种血管活性物质参与RAS的活化效应过程，局部产生的过量AngⅡ还能作为一种重要的生长因子参与细胞生长、纤维化、免疫调节等过程，引起肾脏损伤[2, 3]，但其具体作用机制尚未完全阐明。黄芪甲苷(astragaloside-IV，As-IV)是传统中药黄芪药理活性的主要物质之一。现代研究表明As-IV具有抗衰老、抗炎抗病毒、抗氧化的药理作用[4]。本研究选用Ang II刺激大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cells，GMCs)模拟肾损伤细胞模型，通过观察不同剂量As-IV对Ang II介导肾小球系膜细胞增殖及炎症介质表达的影响，从细胞水平研究As-IV抑制GMCs炎症因子表达的可能机制，为进一步认识和评价As-IV治疗肾脏疾病提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

GMCs株由皖南医学院弋矶山医院中心实验室馈赠。

1.2 试剂

As-IV，上海源叶生物科技有限公司；AngⅡ，北京索莱宝科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)，美国Sigma公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)，美国Sigma公司；低糖DMEM培养基，美国Hyclone公司；胎牛血清，美国Gibco公司；DCFH-DA荧光探针，美国Sigma公司；MCP-1 ELISA检测试剂盒，武汉华美生物工程有限公司；TGF-β1一抗，美国CST公司。

1.3 细胞培养

将冷冻于液氮罐中的细胞株取出按常规方法复苏后，接种于完全培养基(含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基)的培养瓶中。置于5%CO2、37℃的培养箱中避光培养。待细胞融合至80%，进行消化传代。取5～7代对数生长期细胞用于实验。

1.4 血管紧张素Ⅱ最佳浓度的筛选

1.5 As-IV给药方法与剂量设置

将As-IV用DMSO助溶后用低糖DMEM培养液稀释至相应浓度与AngⅡ共孵育给药，将实验细胞分为5组：正常对照组、AngⅡ(10-6mol/L)组、AngⅡ(10-6mol/L)+As-IV(25 μmol/L)组、AngⅡ(10-6mol/L)+As-IV(50 μmol/L)组、AngⅡ(10-6mol/L)+As-IV(100 μmol/L)组。MTT实验设6个复孔，ELISA实验设5个复孔，流式细胞术及Western blot实验设3个复孔，各组细胞培养48 h后进行实验。

1.6 MTT比色法检测细胞增殖

取对数生长期细胞接种于96 孔板上，完全培养基培养24 h，待细胞生长至80～90%，换无血清的低糖DMEM 培养液继续孵育24 h使其同步化，随机分为5组(分组如下)：每组设立6个复孔。置于 37℃、5%CO2的培养箱中培养48 h。每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，置于 37℃、5%CO2的培养箱中避光孵育4 h。吸尽各孔上清液，每孔加入150 μl DMSO，溶解振荡10 min，用酶标仪于490 nm波长处检测各孔吸光度(optical density, OD)值。细胞增殖率= ( 处理组A490/对照组A490) × 100 %。

1.7 流式细胞术检测细胞内ROS水平

取对数生长期细胞接种于6孔板上，用完全培养基培养24 h ，待细胞生长至亚融合状态，换用无血清的低糖DMEM 培养液继续孵育24 h使其同步化，随机分为5组(分组同1.5)：每组设立3个复孔。培养48 h后，吸尽各孔内细胞培养液，每孔加入含10 μmol/L DCFH-DA的无血清培养液1 ml，置于37℃避光孵育20 min，用PBS 缓冲液洗3 次，再用不含EDTA的0. 25%胰酶进行消化，最后用含3%胎牛血清的PBS重悬细胞，上机检测。采用Flowjo7.6软件对结果进行分析，计算DCF平均荧光强度。

1.8 ELISA法检测细胞上清液中MCP-1含量

取对数生长期细胞接种于24孔板上，用完全培养基培养24 h ，待细胞生长至80～90%，换用无血清的低糖DMEM 培养液继续孵育24 h使其同步化。细胞分组培养同“1.5”，每组设5个复孔。48 h后，收集各孔内细胞上清液，离心后待测。操作步骤按照ELISA试剂盒说明严格进行。

1.9 Western blot法检测细胞内TGF-β1蛋白的表达

细胞分组培养同“1.5”，每组设3个复孔，分别加入裂解液，裂解完毕后离心，收集上清液。采用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。蛋白经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移到NC膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。羊抗兔TGF-β1多克隆抗体4℃下孵育过夜。洗膜后加入二抗室温孵育1 h，洗膜后加入ECL试剂显影成像，用Image J软件对灰度值进行分析。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 血管紧张素Ⅱ最佳浓度的筛选

各组细胞经AngⅡ孵育24 h后，可见随着AngⅡ刺激浓度的不断增加，刺激组的OD值明显上升，表明AngⅡ刺激大鼠肾小球系膜细胞发生增殖，并且在AngⅡ10-6mol/L浓度时，细胞增殖最显著(P<0.05)，因此10-6mol/L是本实验中AngⅡ刺激细胞的最佳作用浓度(图1)。

OD： Optical density; GMCs: Glomerular mesangial cells

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

2.2 As-IV对AngⅡ诱导GMC细胞增殖的影响

MTT结果显示，与正常组相比，AngⅡ模型组细胞OD值明显上升(P<0.01)，表明其显著增殖；与AngⅡ模型组相比，AngⅡ+As-IV高、中、低剂量组细胞OD值明显下降，其中，高剂量(100 μmol/L) 组对AngⅡ诱导细胞增殖的抑制作用最显著(P<0.01)，表明As-IV组可以抑制AngⅡ诱导肾小球系膜细胞增殖，且存在浓度依赖性(P<0.05, 表1)。

Group DoseODControl -0.563±0.031Model 10-6 mol/L0.824±0.036∗∗As-IV25 μmol/L0.753±0.023#As-IV50 μmol/L0.659±0.027##As-IV100 μmol/L0.597±0.022##

**P<0.01vscontrol:#P<0.05，##P<0.01vsmodel

2.3 As-IV对AngⅡ诱导GMC细胞中ROS含量的影响

流式细胞仪检测结果显示；与正常组相比，AngⅡ模型组细胞内 ROS 生成量显著增多(7.6±0.8vs45.3±2.6，P<0.01)；与AngⅡ模型组相比，AngⅡ+As-IV高中低剂量组细胞内ROS生成量明显减少，并呈一定的剂量依赖性(P<0.05)，分别为低剂量组(36.9±2.3)、中剂量组(26.4±1.7)、高剂量组 (17.6±1.8)，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

2.4 As-IV对AngⅡ诱导GMCs细胞中MCP-1分泌的影响

ELISA结果显示，正常条件下，肾小球系膜细胞上清液中有少量MCP-1的表达，AngⅡ刺激细胞24 h后，细胞上清液中MCP-1分泌显著增加，与正常组相比差异具有统计学意义(P<0.01)，与AngⅡ模型组相比，AngⅡ+As-IV高、中、低剂量组细胞上清液中MCP-1表达量显著下降(P<0.05，P<0.01)，其中高剂量(100 μmol /L) 组作用最显著(P<0.01)，可将MCP-1分泌量由(196.25±16.52)pg/ml降低到(102.91±11.28)pg/ml，表明一定浓度As-IV(25～100)μmol/L可呈剂量依赖性抑制AngⅡ诱导GMC细胞上清液中MCP-1的表达(P<0.05, 表2)。

Fig.2Effects of As-IV on intercellular ROS levels of glomerular cells induced by AngⅡ

MFI: Mean fluorescence intensity; ROS: Reactive oxidative species

**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsmodel

Group DoseMCP-1Control -85.63±11.72Model10-6 mol/L196.25±16.52#As-IV25 μmol/L166.67±12.61∗As-IV50 μmol/L131.91±11.45∗∗As-IV100 μmol/L 102.91±11.28∗∗

MCP-1: Monocyte chemoattractant protein-1

**P<0.01vscontrol:#P<0.05，##P<0.01vsmodel

2.5 As-IV对AngⅡ诱导GMC细胞中TGF-β1蛋白表达的影响

Western blot 免疫印迹法结果显示，与正常组相比，AngⅡ模型组细胞内TGF-β1蛋白表达量显著上升(P<0.01)。与AngⅡ模型组相比，AngⅡ+As-IV高、中、低剂量组细胞内TGF-β1蛋白的表达均有不同程度的降低(P<0.05，P<0.01)，其中高剂量(100 μmol /L) 组作用最显著(P<0.01)，可将TGF-β1蛋白与内参灰度值相对比值从AngⅡ模型组的0.789±0.018降至0.068±0.016，表明一定浓度的As-IV(25～100 μmol/L)可抑制AngⅡ诱导GMC细胞内TGF-β1蛋白的表达(图3)。

Fig.3Effects of As-IV on TGF-β1 protein expression of glomerular cells induced by AngⅡ

TGF-β1 : Transforming growth factor-β1

**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsmodel

3 讨论

DN病变过程中系膜细胞增殖具有重要的病理作用。近年来局部RAS活化被认为是DN病情进展的主要机制之一[5]。本实验用AngⅡ刺激GMCs模拟DN体外模型，结果显示AngⅡ可以有效刺激GMCs细胞增殖。已知AngⅡ是RAS中一种重要的生物活性肽，它不仅作为一种血管活性物质参与RAS的活化效应过程，局部产生的AngⅡ还能作为一种重要的生长因子参与细胞生长、纤维化、免疫调节等过程。为确定AngⅡ最佳作用浓度，本研究利用浓度梯度实验，确定了AngⅡ造模的最佳浓度为10-6mmol /L。AngⅡ在发挥生理作用之前先与细胞表面特定的受体结合，AngⅡ的作用主要通过血管紧张素受体1(AT1)受体所介导，产生一系列生物学作用，如ROS，促发炎症因子分泌等。AngⅡ与AT1受体结合后可产生ROS[6]，ROS作为极其重要的细胞内信使，在正常肾脏中会少量产生。当受到AngⅡ、高糖等一系列因素刺激后，ROS过量产生，进而打破肾脏氧化与抗氧化系统平衡[7]，过量的ROS是引起糖尿病肾损伤多条通路激活的共同途径[8]，在ROS生成酶丰富的肾脏细胞中，ROS可作为细胞内信使，激活多种氧化还原敏感性信号通路，引发肾脏细胞损伤。本研究采用流式细胞术观察各组细胞内ROS含量，发现正常情况下GMCs细胞中表达少量的ROS，当AngⅡ刺激细胞24 h后，ROS生成量明显增多，细胞发生氧化应激。这与Zhang F等研究结果相一致[9]。

单核细胞趋化蛋白1( monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)是CC趋化因子家族中的一种炎性趋化因子。病理状态下MCP-l 过度表达，不仅引发单核-巨噬细胞聚集活化，还可通过自分泌或旁分泌的形式直接刺激肾脏细胞释放炎症介质和细胞因子[10]，如TGF-β1、IL-1、结缔组织生长因子等，其中，TGF-β1在体内的主要生物学效应是通过自分泌和旁分泌直接促进系膜细胞、肾小管细胞肥大，促进细胞外基质分泌与积累，参与肾小球硬化及肾间质纤维化等病理过程，加重肾损伤，最终引发终末期肾衰[11]。本研究发现，正常情况下GMCs细胞中表达少量的MCP-1及TGF-β1，当AngⅡ刺激细胞24 h后，MCP-1及TGF-β1分泌量明显增多。与文献报道一致。表明AngⅡ能刺激肾脏发生炎症反应，促进炎性因子的表达，引发和加重肾损伤。

目前，临床上应用血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)联合AngⅡ受体拮抗剂(angiotensin Ⅱ receptor antagonist, ARB)治疗糖尿病肾病，如贝那普利、缬沙坦等，具有良好的治疗效果，但少数病人出现的不良反应仍不容忽视。中药具有多靶点、毒副作用小的优点。黄芪(Astragalus membranaceus)是我国传统名贵中药材，具有益气固表、利尿排毒、排脓、敛疮生肌等功效。对心血管系统疾病、消化系统疾病、神经系统疾病均有一定疗效[12]。As-IV是黄芪药理活性的主要物质之一，是黄芪发挥作用的有效成分群。本研究观察不同浓度的黄芪甲苷对AngⅡ诱导大鼠肾小球系膜细胞的增殖及相关炎症因子的表达的影响，结果表明，黄芪甲苷能够抑制AngⅡ诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖、ROS水平、MCP-1及TGF-β1的表达，提示黄芪甲苷可能通过缓解氧化应激从而减轻肾小球的炎性反应，这可能是黄芪甲苷保护肾脏的重要机制之一, 为进一步认识和评价As-IV治疗肾脏疾病提供理论和实验依据。