花青素对完全弗氏佐剂诱导慢性炎性痛的镇痛作用及其机制*

2018-02-21陈泽峰和春霞王莉莉郑嘉慧王占磊鲁亚平

中国应用生理学杂志 2018年5期

王静，陈泽峰，和春霞，王莉莉，郑嘉慧，张皓，王占磊，鲁亚平

(1. 皖南医学院基础医学院生理学教研室， 2. 皖南医学院2013级临床专业， 3. 皖南医学院2015级临床专业， 4. 皖南医学院2014级麻醉专业, 安徽芜湖 241002； 5. 安徽师范大学生命科学学院, 安徽芜湖 241002)

慢性痛已成为影响人类劳动能力和生存质量的最普通、最直接的因素，但关于慢性痛的机制尚不十分明确，天然而副作用小的镇痛药物也有待开发。研究证实，瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid type1， TRPV1)同时参与慢性痛外周敏化和疼痛中枢调控，在慢性炎性痛中具有重要作用[1,2]。

花青素是一类广泛存在于高等植物的果实、花、茎等器官中的黄酮类化合物，已有研究发现花青素具有抗氧化、抗炎镇痛、抑菌、抗衰老、抗癌作用以及对肝脏、心脑血管和视力的保护作用[3-5]。本课题组前期研究结果已证实花青素具有抗炎镇痛作用，金叶女贞果实花青素能抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的增加，抑制棉球所致肉芽肿增生，提高小鼠热痛阈，降低醋酸致小鼠扭体次数，其抗炎镇痛机制与增强小鼠抗氧化能力和降低炎性因子NO和PGE2生成有关[6,7]。

炎性痛模型有：福尔马林炎性痛模型，弗氏佐剂炎性痛模型(分为多发性佐剂炎性痛模型和单发性佐剂炎性痛模型)，角叉菜胶炎性痛模型，蜂蜜毒炎性痛模型，松节油炎性痛模型。福尔马林模型和角叉菜胶模型常用于急性和亚急性炎症模型。弗氏佐剂、蜂蜜毒、松节油常用于诱导慢性炎性痛模型，蜂蜜毒诱导的炎性痛呈现多种疼痛表现型，多发性弗氏佐剂诱导的模型病变范围较广，涉及多器官系统免疫性病变，适合于进行抗类风湿的药物研究和自身免疫性疾病的研究。单发性佐剂炎性痛模型克服了多发性佐剂关节炎模型的缺点，将弗氏佐剂注入足底皮下而非足内，造成局部组织周围炎症，痛觉过敏持续2～3周，是目前最常用的经典慢性炎性痛模型[8]。本研究拟用单发性佐剂炎性痛模型(完全弗氏佐剂)诱导经典慢性炎性痛大鼠模型，观察花青素对慢性炎性痛大鼠的镇痛作用，分析其对慢性炎性痛大鼠炎性因子的释放及中枢海马区TRPV1表达的影响，试图阐明金叶女贞果实花青素抗炎镇痛作用可能的中枢机制，为镇痛中药的筛选提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，实验动物生产许可证号：SCXK(浙)20080033。30只大鼠随机分为三组(n=10)：(1)生理盐水对照组(normal saline control group, NS), 左后肢足底注射生理盐水100 μl；(2)慢性炎性痛模型组(chronic inflammatory pain model, Mod)，左后肢足底中部注射完全弗氏佐剂(complete freund’s adjuvant, CFA)100 μl复制慢性炎性痛模型；(3)花青素治疗组(anthocyanin treatment, Ant)，左后肢足底注射CFA 100 μl，同天开始灌胃给药花青素(纯花青素粉末用生理盐水配制，根据前期实验结果确定给药浓度90 mg·kg-1)连续给药14 d。

1.2 主要仪器与试剂

PL-200热刺痛仪(成都泰盟科技有限公司)，BW-YLS-3E 电子压痛仪(上海软隆科技)，YLS-7B足趾容积测量仪(上海软隆科技)，UV-3200PCS紫外分光光度计(上海美谱达仪器)，Model-680型酶标仪(美国BIO-RAD公司)。完全弗氏佐剂(sigma)。

1.3 花青素的提取与纯化

金叶女贞果实经筛选、清洗后置于烘箱中，50℃烘干至恒重，粉碎过80目筛，加75%的乙醇(料液比1∶15)经微波化学反应器提取，提取液抽滤去除滤渣得粗提液。粗提液经DM130大孔树脂柱吸附，吸附完全后，以大量的蒸馏水冲柱去糖，再经石油醚萃取去脂类，得到去糖去脂花青素，最后置于冻干机中冻干，得到纯花青素粉末，使用时用生理盐水配置的花青素溶液。

1.4 慢性炎性痛模型建立

完全弗氏佐剂(complete Freund’S adjuvant，CFA)是一种常用的致炎剂，能够造成注射局部炎症，从而引起伤害性反应，是建立慢性炎症痛模型最常用的药物。具体操作：消毒大鼠左侧后肢及足底，经足底皮下注射CFA100 μl，注射后按压数分钟，促进药物吸收。造模成功标准依据文献[9]判定。

1.5 行为学观察

1.5.1 大鼠体重监测实验开始前(记作T0)和术后第1、3、5——13日(记作T1、T3、T5——T13)相同时间点测量各组大鼠体重。

1.5.2 足趾容积测量用足趾容积测量仪在实验开始前(T0)和术后第1、3、5——13日(T1、T3、T5——T13)相同时间点测量大鼠左侧后足趾容积。

1.5.3 热痛阈值检测清醒大鼠放入测试箱中，室温、安静状态下热刺痛仪热光源分别照射大鼠左足底部，当大鼠出现抬足、舔脚反应时的时间为热痛阈(Heat pain threshold，HPT)。当时间达到30 s，而大鼠仍无反应时便停止照射，以免损伤皮肤，并以30 s作为最高痛阈。痛阈测定时每组循环测定3次，两次时间间隔大于5 min，取3次的平均值作为HPT。各组大鼠均于CFA术前、术后第1、3、5、——13日测定HPT。

1.5.4 机械痛阈值检测清醒大鼠在室温、安静状态下,将左侧后肢足背部置于压痛仪硅板上，并在足背部皮肤做一标记，脚踩踏板增加压爪强度，当大鼠出现缩腿、挣扎、嘶叫时，踩下踏板，此时压强为机械压痛阈值(mechanical pain threshold, MPT)。当压力达到250 g，而大鼠仍无反应时便停止压爪，以免损伤皮肤，并以250 g作为最高痛阈。痛阈测定时每组循环测定3次，2次时间间隔大于5 min，取3次的平均值作为MPT。各组大鼠均于CFA术前、术后第1、3、5——13日测定MPT。

1.6 检测方法

术后第14日实验结束，取动物血清，比色法测定血清SOD、NO、MDA和PGE2含量，具体方法按试剂盒说明进行。另取海马区组织迅速置于液氮中保存，使用前冰上解冻组织，按照每10 mg组织加入100 μl裂解液的比例加入加RIPA裂解液。用超声破碎仪在冰上进行超声匀浆，直至充分裂解，然后12 000 r/min离心20 min，取上清按一定比例与上样缓冲液混合，100℃煮沸5 min，冰上迅速冷却后-20℃储存。Western blot实验取样品20 μl经SDS-PAGE→转膜→封闭→一抗孵育→二抗孵育→显影→洗脱→拍照→条带分析。分析海马区p-TRPV1和TRPV1蛋白的表达。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 花青素对慢性炎性痛大鼠体重的影响

表1显示三组大鼠体重在实验的两周内均呈缓慢增长趋势，各组间没有明显差异。

2.2 花青素对慢性炎性痛大鼠足趾容积的影响

表2显示：与NS相比，Mod组和Ant组在术后第1日，足趾容积明显增大(P<0.05), 术后第3日足趾肿胀最明显(P<0.01)，随后足趾肿胀度逐渐缓解，但与NS组相比一直有明显差异(P<0.01)；在术后第7日，Ant组足趾容积显著低于Mod组(P<0.05)。

2.3 模型组大鼠左后侧足趾肿胀度监测

图1显示的是NS，Mod，Ant三组大鼠在术后第1、5、9、13日后肢足趾照片。NS组大鼠左后足趾没有出现肿胀；Mod组大鼠左后足趾明显出现肿胀并一直持续14 d；Ant组大鼠左后足趾也出现明显肿胀，但后期逐渐缓解，具体各组大鼠左后足趾容积见表2。

2.4 花青素对慢性炎性痛大鼠热痛阈的影响

表3显示各组在术前热痛阈值没有明显差异，与NS组相比，术后第3日Mod组和Ant组热痛阈值降低最为显著(P<0.01)，随后热痛阈缓慢上升，术后第7日，Ant组的热痛阈开始接近NS组，且Ant组的热痛阈明显高于Mod组(P<0.05)。

Fig.1Hind toes in each group after operation (T1，T5，T9，T13 mean 1，5，9，13 days after operation)

2.5 花青素对慢性炎性痛大鼠机械痛阈的影响

表4显示：与NS组比较，Mod组和Ant组大鼠机械痛阈值在术后第3日出现明显降低(P<0.01)，Mod组在术后第11日机械痛阈值有所缓解，Ant组在术后第7日机械痛阈值开始上升。在术后第9日，Ant组的机械痛阈值开始明显高于Mod组(P<0.05)。

2.6 花青素对慢性炎性痛大鼠血清生化指标的影响

表5显示，与NS组比较，Mod组大鼠血清中SOD水平降低(P<0.05)，MDA、NO和PGE2水平明显升高(P<0.01)；与Mod组比较，Ant组大鼠血清中SOD含量升高(P<0.01)，MDA、NO和PGE2含量有所降低(P<0.05)。

2.7 花青素对慢性炎性痛大鼠海马区TRPV1表达的影响

Western blot结果显示，与NS组比较，Mod组和Ant组大鼠海马区总TRPV1和p-TRPV1表达均显著提高(P<0.01，P<0.05)；与Mod组比较，Ant组大鼠海马区p-TRPV1表达降低(P<0.05，图2，表6)。

Fig.2Effects of anthocyanin on the expressions of TRPV1 and p-TRPV1 in hippocampus of rats with chronic inflammatory pain