4周中等强度有氧运动诱导大鼠心房肌蛋白质组差异表达的研究*

彭 勇 , 史绍蓉, 黄思敏 , 郭远盘 , 徐 哲, 万莉莉, 雷 雄

(1. 南京体育学院运动健康科学系, 江苏 南京 210014； 2. 湖南师范大学体育学院, 长沙 410012; 3. 肇庆学院体育与健康学院, 广东 肇庆 526061； 4. 湖南外国语职业学院, 长沙 410116; 5. 湖南城市学院体育系, 益阳 413039； 6. 长沙医学院基础医学系, 湖南 长沙 410219)

生命功能的直接执行者是蛋白质，心肌全蛋白质组的适当表达是心脏功能正常运行的物质基础，有氧运动能够改善心血管疾病患者心脏功能，亦可能得益于有氧运动诱导心肌蛋白质组发生良性表达，因此研究有氧运动诱导心肌蛋白质组差异表达有利于从整体生理学的角度阐释运动心脏康复过程的生物分子机制。Rocha、Sun[1,2]分别研究8周有氧游泳训练对心肌蛋白质组差异表达，Rocha发现高强度游泳训练诱导α-MyHC、MRS2和NADH脱氢酶等蛋白上调的同时可能诱发心肌损伤，Sun发现机体通过增加苹果酸脱氢酶、ATP合成酶亚基α、异柠檬酸脱氢酶[NAD]亚基等蛋白的表达强度，增强线粒体氧化代谢能力，而改善心脏代谢能力。Patrícia[3]研究高强度的抗阻训练对左心室蛋白质组的影响，发现类似于心脏衰竭初期的能量代谢变化(糖酵解代谢相关蛋白Llactate脱氢酶B链和甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶过度表达)，也观察到热休克β-6等多种应激保护性蛋白质增加表达，认为机体通过激活途径避免左心室重大损伤并延缓病理性肥大的发病。史绍蓉、刘田、龚丽[4-6]等研究一次急性力竭训练和长期大强度运动负荷训练对心房肌、心室肌蛋白质组差异表达影响，发现大强度训练使心肌蛋白质组发生显著差异性变化，心肌收缩调节蛋白原肌球蛋白1表达缺失或下调，糖酵解代谢相关蛋白增加，可能诱发心肌疲劳出现。

综上所述，高强度训练虽能提升心肌细胞的能量代谢、增强心肌收缩能力，但是高强度训练也可能诱发心脏的病理结构重塑，导致心脏急性损伤甚至猝死，相比高强度训练，中等强度有氧运动可能更安全、有效的增强心脏功能。研究表明长期的中等强度有氧运动可以改善左、右心室肌能量代谢酶的表达，增加ATP合酶α亚基、丙酮酸脱氢酶E1α1表达量，20 kDa 的热休克蛋白和葡萄糖调节蛋白78等应激保护蛋白增加，增强心肌细胞对运动负荷的应激保护能力[7,8]。目前，运动心脏重塑过程蛋白质组学变化的研究主要集中在左、右心室，但运动诱导的心脏重塑不仅仅发生在左、右心室，充当内分泌器官、储蓄、管道、辅泵的心房在其中的作用也不容忽视。

鉴此，本实验应用比较蛋白质组学研究方法与技术，研究4周中等强度有氧运动下大鼠心房肌组织中对运动适应具有重要意义的目标蛋白及其基因的差异表达特征，从蛋白质组整体水平探讨有氧运动心脏重塑过程中的分子机制，为运动心脏重塑和慢性心血管疾病运动康复研究提供研究依据与方向。

1 材料与方法

1.1 实验对象与运动动物模型

20只雄性SD大鼠购于湖南农业大学实验动物部，2月龄，体重为(232±8.3)g，Ⅱ级实验动物。按国家标准啮齿类动物饲料喂养，自由进食和饮水。适应性训练1周后(适应性训练方案：第1日10 min×10 m·min-1，第2日10 min×15 m·min-1，第3日18 min×15 m·min-1，第4日21 min×20 m·min-1，第5日24 min×20 m·min-1)，20只大鼠按照体重随机配对分为对照组、实验组(n=10)。

参考Hsieh 和Bedford[9，10]建立4周中等强度有氧运动实验动物模型。大鼠购入后第一周进行5 d适应性跑台训练(跑台坡度为0)，此后，对照组大鼠饲养笼中自由活动，不进行跑台训练。正式训练阶段，实验组跑台速度为24 m·min-1，持续训练40 min/次(运动负荷强度相当于60%～70%VO2max)，每周训练6 d，周日休息，持续训练4周。

1.2 仪器与试剂

主要仪器设备和试剂参考史绍蓉的相关研究文献[4]。主要实验仪器有实验动物跑台(国产，型号：BW-BTW-703)、蛋白质分离等电聚焦电泳系统(美国GE Heathcare公司；型号：Ettan—IPGPhor 3)、聚丙烯酰胺凝胶电泳垂直平板电泳系统(美国Bio-Rad公司；型号：Powerpac Universal)、基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF)(德国Bruker;型号：ultraflex)紫光图像扫描仪(清华紫光上;型号：Uniscan -D3000) 、低温冷却液循环泵(国产；型号：DLSB-210)。

主要实验试剂有固相pH梯度等电聚焦干胶条(Amersham公司，Immobilized dry strip pH3～10 L、长度18 cm)，TEMED(美国、LOT : C78-33)、BIS-Acrylamide购于Amersham Pharmacia公司(LOT : 189713011)；IAA、DTT、硫脲均购于Sigma公司(LOT 分别为：43214、56432、67890)；APS、溶解酵素购于Bio-rad公司；尿素、NP-40、载体两性电解质(Parmalyte 3～10 )、PMSF、CHAPS、SDS、丙烯酰胺均购于Amersham Pharmacia公司。

1.3 样品制备

4周运动的末次训练结束后6 h ，实验组、对照组大鼠称重后并适量麻醉，打开胸腔暴露心脏， 使用4℃的生理盐水灌流心脏之后，并迅速摘除心脏称取重量， 用4℃冷生理盐水反复冲洗干净，滤纸充分吸干水分并称量心脏重量， 分离心房肌组织并放置液氮中冷冻贮存备用。心房肌组织的样品蛋白提取方法与技术参照文献[11]，心房肌组碾磨成粉末，将粉末状样品称重后，按质量与体积比1∶4(mg:μl)加入心肌组织裂解液，4℃温度下振匀30 min。裂解后高速冷冻离心机中离心，取出样品后用移液枪吸取上清液，分别将实验组和安静组的组内大鼠心房肌组织上清液合并在一起。采用Bradford法对样品蛋白质含量进行测定，运动组样品蛋白含量32.86 μg/μl，对照组样品蛋白含量31.57 μg/μl，。将样品以1 mg量分装EP管，在-70℃冰箱中保存备用。

1.4 双向凝胶电泳方法与图像分析

参考Gorg[12]的方法和IPGhorTM 等电聚焦系统操作指南进行固相- pH 梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(2- DE)操作，对照组、实验组各重复进行3次电泳， 2- DE凝胶染色采用改良的考马斯亮蓝染色法。清华紫光D3000图像扫描仪透射扫描凝胶所获得图谱，ImageMaster 2D Platinum图像分析软件进行详细分析，对照组、实验组的3张电泳图谱平均匹配率分别为64.57%±2.35%、62.48%±1.50%，分析比较对照组和实验组图谱上蛋白质斑点差异。

1.5 质谱鉴定分析

应用串联飞行时间质谱仪对筛选的差异蛋白质鉴定， 选取一级质谱的肽质量指纹图谱上峰值较高的肽段峰进行二级质谱鉴定， 以对一级质谱鉴定的蛋白质进行进一步的确证。

1.6 RT-PCR检测

取心房肌组织0.1 g，提取心房肌总RNA。心房肌研磨成粉末状后，加入1 ml Trizol，室温放置5 min，使其充分裂解，12 000 r/min高速离心5 min，弃沉淀。加入200 μl氯仿，混匀室温放置5 min后，高速离心5 min。离心后，抽取上层水相转至另一离心管中，加入异丙醇(0.5 ml异丙醇/ml Trizol)，室温放置10～30 min。然后高速离心10 min，弃上清，RNA沉于管底，加入75%乙醇(1 ml/ml Trizol)，温和震荡悬浮沉淀。高速离心5 min，弃上清，超净工作台里室温晾干。加入20 μl DEPC水使RNA溶解，恒温水浴箱中(55℃～60℃)下孵育10 min助溶。经RT-PCR扩增反应观察部分目标蛋白的基因表达情况。反转录反应体系20 μl，45℃中变性60 min。然后终止反应：70℃，5 min，保存于-70℃。

PCR反应物总体积50 μl，内含反应物1 μl cDNA、0.5 μl Tap DNA polymerase、1 μl 10 mmol/L dNTP、1.5 μl Forward primer、3 μl 25 mmol/L MgCl2、1.5 μl Reverse primer、5 μl 10×PCR buffer、35.5 μl无离子水。

目标蛋白引物序列如表1。

PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，电泳完成后，采用Tannon凝胶分析系统拍照分析上述电泳的凝胶条带，比对分析样品和内参条带的净光密度比值(OD)。

1.7 统计学处理

Tab. 1 The situation of target protein primers

2 结果

2.1 心脏重量变化结果

4周有氧运动后与对照组比较，实验组大鼠心脏重量增加6.2%、心脏重量指数(心脏重量/体重)增加13.7%(表2)，心脏重量的增加没有统计学意义，心脏重量指数增加的差异具有统计学意义(P<0.05)。

GroupHeart weight(mg)Cardiac weight index(mg/g)Control group970±2102.48±0.19Test group1030±902.82±0.14∗

*P<0.05vscontrol group

2.2 中等强度有氧运动后心房肌2-DE图谱结果

通过ImageMaster 2D Platinum软件分析，对照组、实验组分别平均检测到370±35个蛋白质点、422±7个蛋白质点。心房肌蛋白质点的分子量范围主要在20 kD～100 kD之间，超过100 kD以上，低于20 kD以下的蛋白质点数目很少。pH值主要介于4～9之间，集中分布在酸性端和中性端蛋白质点数目较多，极酸性和极碱性的蛋白质点很少(图1)。

Fig.12-DE representative map of atrial muscle protein after 4 weeks exercise

图2显示，4周中等强度有氧运动后，实验组与对照组对比，大鼠心房肌没有出现“缺失”或“新增”的蛋白点，共筛选比对出 53 个差异表达蛋白质点。其中运动后表达量增强2 倍以上有29个，增强5 倍以上的点有5个，下调至20%以下的蛋白质点8 个，下调至50%以下的蛋白质点有23 个。

Fig.2Differential expression maps of atrial muscle proteome in control and experimental rats

The points were marked with letters in the image are protein spots of the atrial muscles which expression are up-regulated more than 2 times or down-regulated to below 50% after 4 weeks of exercise. The points were marked with numbers in the image are the protein spots which expression level increase more than 5 times or down to below 20% after exercise, and the histograms of the surrounding indicate their expression level

2.3 目标蛋白质点的质谱鉴定

4周中等强度有氧运动后大鼠心房肌中表达量上调≥5倍或下调超过80%的13个备选目标蛋白质点(SSP265号、107号、244号、723号、218号、236号、273号、393号、258号、165号、449号、403号、481号)应用串联飞行时间质谱仪器进行鉴定，获得的肽谱和肽段氨基酸结果在ncbi数据库检索，鉴定出8个蛋白质和一个未知蛋白(分子量54.669 kDa，等电点6.21)，具体信息见表3。

Tab. 3 The results of mass spectrometry of the target protein spots

图3、4分别为265号点丙酮酸脱氢酶E1α1的一级、二级质谱图，二级质谱图是一级质谱图中选取若干肽段进行再次质谱鉴定获得，其中二级质谱图的肽段峰值为1540.720，图中的横坐标、纵坐标分别代表肽段(分子离子的质荷比)、肽段峰值(相对丰度)。

Fig.3First spectrum

Fig.4Secondary spectrum

2.4 目标蛋白质mRNA表达结果

4周中等强度有氧运动后，实验组与对照组相比，运动后大鼠心房肌中的甲基丙二酸半醛脱氢酶mRNA表达量降低(P﹤0.05)；线粒体二氢硫辛酸脱氢酶、蛋白质二硫键异构酶A3、线粒体乌头酸水合酶、谷胱甘肽合成酶的mRNA表达量降低(P﹥0.05)；异戊烯辅酶A脱氢酶mRNA表达量高于对照组(P﹥0.05，表4)。

3 讨论

3.1 中等强度有氧运动心脏结构的适应变化

3.1.1 中等强度有氧运动对心脏形态变化的影响 心脏重量指数是辅助判断心脏肥大的指标，本研究实验组大鼠心脏重量和心脏重量指数(心脏重量/体重)分别增加6.2%、13.7%，其中心脏重量指数的增加具有统计学意义(P<0.05)。拟推测经过4周中等强度有氧运动后可能诱发心脏出现适应性生理性肥大，心脏形态发生变化，增强心肌收缩力和泵血功能，与佟长青[13]等研究结果一致。

3.1.2 中等强度有氧运动对心房肌蛋白质变化的影响 本研究未观察到运动后心房肌有 “缺失”或“新增”的蛋白质点，共筛选比对出差异表达蛋白质点 53 个。史绍蓉、刘田、龚丽[4-6]等发现心房肌和心室肌在一次急性力竭运动及递增负荷大强度运动后出现多个“缺失”的蛋白质点，认为可能与运动强度过大有关，心肌细胞在运动中产生强烈应激，损伤心肌细胞，抑制或降解部分蛋白质。Boluyt[14]等发现 6 周大强度耐力运动后，心肌中新增12 个的蛋白质点。

从上述运动心肌蛋白质组的差异表达研究结果分析，运动心脏重塑过程中，运动负荷强度大小、训练时间和周期的长短等因素会影响心肌蛋白质组的差异表达。运动心脏的重塑过程可能通过诱发心房肌蛋白质组的重塑而实现心脏形态、结构、生理功能上的重塑。

3.2 中等强度有氧运动诱导心房肌蛋白质组适应性变化

3.2.1 中等强度有氧运动对心房肌物质能量代谢蛋白的影响 研究证据表明，长期运动刺激条件会促使心肌细胞的能量代谢途径发生变化，在运动心脏重塑，运动性心肌肥大的过程中也伴随着心脏能量代谢途经的适应性优化的发生。Vettor[15]等发现长期耐力训练能改善糖尿病心肌病大鼠的糖、脂代谢功能，促进线粒体转录因子A的表达，增加葡萄糖利用率，而优化心肌能量代谢的效果。因此，运动诱导心肌细胞能量代谢优化，这一代谢适应特征能有效的应用在慢性心血管疾病运动康复治疗与预防领域。

Tab. 4 Relative net optical density value of target protein n=10)

*P<0.05vscontrol group

本实验观察到，4周中等强度有氧运动诱导心房肌中线粒体乌头酸水合酶(ACO2)表达量上调了5.7倍，史绍蓉研究急性力竭运动发现，该蛋白在大鼠心房肌运动后表达量上调了15.42倍，分析力竭运动迫使心房肌对能量需求增加，机体通过增加乌头酸酶的表达来加速能量代谢过程，满足力竭运动能量需求[4]。相反，徐哲的研究结果显示8周与本实验相同运动强度的有氧运动后右心室肌中该蛋白表达量下调了11.3倍[16]。结合以上研究结果分析，ACO2的适应表达在不同强度、不同持续训练周期的运动中表达量存在差异，本实验4周中等强度有氧运动使乌头酸水合酶表达增加，通过催化柠檬酸氧化形成异柠檬酸，使三羧酸循环关键环节加速，以改善与优化心脏能量供应。同时实验发现丙酮酸脱氢酶E1α1在实验组心房肌表达量上调6.4倍，王娟[7]研究发现丙酮酸脱氢酶E1α1在 12周中等强度运动后右心室肌上调33.3倍，该蛋白的表达随着机体慢慢地对运动强度发生适应，出现了时间适应性高表达表现，以提高心肌氧化代谢能力。因此推测长期中等强度有氧运动可能促进丙酮酸脱氢酶E1α1在不同心肌组织部位增强表达量，其结果是加速机体内丙酮酸氧化脱羧基，为心肌三羧酸循环过程提供足够的乙酰- CoA，改善心脏能量供应，增强心脏收缩泵血能力。

本实验观察到4周运动使心房肌异戊酰辅酶A脱氢酶、线粒体二氢硫辛酸脱氢酶的表达量分别下调6.9倍、5.7倍，心肌细胞能量代谢活跃，耗氧量需求很大，且成熟的心肌细胞活动能量供应过程主要由糖有氧氧化供给，氨基酸的供能比例很少。Hafstad[17]的研究显示中等强度跑台运动(65%～70%VO2max)提高大鼠心肌葡萄糖的利用率，提高机体有氧能力。推测4周中等强度有氧运动并未大量动员氨基酸供能，为了节省机体氨基酸与蛋白质，运动后抑制心房肌上述2个蛋白的表达，达到物质节省的目的。

综述所述，4周中等强度有氧运动可能通过上调心房肌中丙酮酸脱氢酶E1α1、线粒体乌头酸水合酶等三羧酸循环代谢有关的蛋白，下调与氨基酸分解代谢有关的酶，提高心肌细胞糖的利用率，优化心肌细胞能量代谢途经。

3.2.2 中等强度有氧运动对心房肌肥大增殖蛋白的影响 723号点经质谱鉴定为丝裂素活化蛋白激酶3， MAPK在心肌细胞增殖、肥大或心肌重构的过程中起着重要信号介导作用。本实验运动后心房肌中该蛋白上调7.3倍，同时王娟[7]亦观察到该蛋白在12周中等强度运动后右心室肌中表达量上调，可见60%～80% VO2max中等强度有氧运动能够诱导心房、心室肌组织中丝裂素活化蛋白激酶3增高，作用于心肌组织诱发心肌细胞肥大，增强心脏收缩泵血能力，满足运动过程中血流增加的需求。其原因可能是长期有氧运动过程中，心脏血流加速对心腔内壁的冲刷增强，作用于心肌细胞的牵拉负荷增强，同时运动使得血管紧张素Ⅱ、儿茶酚胺等神经内分泌变化，血管紧张素Ⅱ能调节心肌细胞中多种离子电流或通道功能，是压力负荷导致心肌肥厚的重要体液因子，闫秋丽[18]认为L-型钙离子通道在血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心肌肥大过程中，发生重要改变并激活心肌细胞上血管紧张素Ⅱ1型受体。侯香玉[19]研究发现大强度游泳耐力训练使MAPK的活性和AngⅡ的含量增加，通过G蛋白耦连受体介导激活MAPK信号通路而增加心肌蛋白质的合成量。

3.2.3 中等强度有氧运动对心房肌抗氧化相关蛋白的影响 273号点经质谱鉴定为谷胱甘肽合成酶，属于谷胱甘肽抗氧化系统中的一员，其主要功能是催化形成谷胱甘肽。本实验谷胱甘肽合成酶运动后表达量下调6.1倍，分析其原因可能是4周运动强度负荷和总量偏小，大鼠心房肌在运动过程中可能未发生强烈的氧化应激，谷胱甘肽合成酶在运动过程中没有出现适应性高表达。毛丽娟[20]在10周递增负荷耐力运动模型中，没有观察到大鼠心肌谷胱甘肽的含量发生明显差异变化，该结果可能是由于不同类型肌纤维导致谷胱甘肽含量的运动适应异同。关于运动对心肌组织谷胱甘肽合成酶差异表达影响尚未有定论，有待于进一步研究探讨。

3.2.4 中等强度有氧运动对心房肌与其他功能蛋白的影响 218号点鉴定为蛋白二硫键异构酶A3，属于折叠酶。其生物功能多样化，具有分子伴侣活性，与脯氨酰4-羟化酶、微粒体甘油三酸酯转运蛋白构成有关，影响蛋白质的折叠、修饰过程[21]。本研究观察到该蛋白在运动后表达量上调5.6倍，推测其上调可能是为了促进一些对心脏、机体运动适应有利的蛋白质表达、折叠。目前运动医学领域对该蛋白的研究缺乏，还需进一步实验探索其运动适应变化特征。

从本实验观察到的结果分析，中等强度运动可能会通过诱导丝裂素活化蛋白激酶3、线粒体乌头酸水合酶(ACO2)、丙酮酸脱氢酶E1α1等蛋白表达量增加，诱导心肌细胞肥大引起心肌细胞能量代谢优化、心脏供能能力增强，心肌适能能力增强等一系列有益变化。

3.3 中等强度有氧运动对目标蛋白基因表达的影响

实验结果显示，与对照组相比较，实验组心房肌的线粒体二氢硫辛酸脱氢酶和谷胱甘肽合成酶 mRNA表达量变化趋势与质谱鉴定所获得这2个蛋白表达量均呈下调趋势，但无统计学上的显著差异性(P﹥0.05)。甲基丙二酸半醛脱氢酶、蛋白质二硫键异构酶A3、异戊烯辅酶A脱氢酶、线粒体乌头酸水合酶等mRNA表达水平与质谱鉴定结果蛋白表达量变化不一致。徐哲[16]研究观察到8周中等强度有氧运动后右心室肌中线粒体乌头酸水合酶表达量下降而其mRNA的表达量则上升，而本研究中该蛋白表达量上调5.7倍，mRNA的表达量下调(P﹥0.05)，二者情况正好相反。中等强度有氧运动对乌头酸水合酶基因、蛋白差异表达的影响可能受不同运动持续时间和不同周期运动训练负荷的影响，这些运动参数的变化可能促使该基因在转录、翻译等过程中发生变化，但其中具体的变化机制有待于进一步的研究。

蛋白质合成过程可能受众多因素影响，比如基因的编码、转录、翻译和翻译后的修饰过程都会影响蛋白质合成和功能，在蛋白质合成过程中的翻译和转录机制发挥不同的调控作用，甚至包括蛋白质分子之间及它与其他生物大分子间的相互联系作用也可能会影响蛋白质表达。因此，有氧运动影响心房肌基因组差异表达是一个非常复杂的过程，上述各蛋白的基因差异表达结果有待更深入研究去确证。

综上所述，4周中等强度有氧运动诱导大鼠心房肌蛋白质组发生显著变化，有13个明显变化的目标蛋白，多数为能量物质代谢酶，这些目标蛋白质的变化与其mRNA表达量的变化并不完全一致，表明中等强度运动可能影响这些目标蛋白质上游基因转录的调控，也可影响下游翻译﹑修饰等的调控，导致表达的差异变化。