有氧运动联合破壁蛋白核小球藻对高脂膳食大鼠脂代谢某些指标的影响*

张 静， 缪 刚， 曹建民， 周海涛△， 牛衍龙， 张 岳 ， 任 奕 ， 包欣悦 ， 邢雅雯

(1. 北京联合大学， 北京 100023， 2. 北京联合大学 生物活性物质与功能食品北京市重点实验室， 北京 100191； 3. 北京体育大学， 北京 100084； 4. 赣南医学院, 江西 赣州 341000)

改革开放以来，人民健康水平和身体素质持续提高。但随着我国工业化、城镇化、人口老龄化进程不断加快，居民生活方式、生态环境、食品安全状况等对健康的影响日益凸显。慢性病发病、患病和死亡人数不断增多，群众经济和精神负担日益沉重。我国居民不良的饮食习惯和生活方式长时间、大范围的存在，导致肥胖人群数量激增。研究证明，日常饮食中过量摄入的热量不仅不能为机体充分、有效地消耗与利用，还会引发体内脂肪合成及游离脂肪酸(free fatty acids，FFA)的异常增多。FFA的增多可以诱发机体脂毒性和肥胖慢性炎症，导致代谢性疾病的发病机率上升。FFA刺激体内脂肪组织释放多种炎症因子。在FFA和炎症因子共同作用下，机体各主要器官长期处于低度炎症状态，最终形成以胰岛素抵抗为主要特征的糖、脂代谢紊乱状态，出现以腹型肥胖、血脂紊乱、糖尿病和高血压等聚集倾向的代谢综合征症候群，引起机体多种代谢性疾病的发生，对人类健康造成极大的威胁[1]。国内外学者对此给予高度的关注。其中肥胖引发的“脂毒性炎症反应”正成为当前研究的热点。运动和营养是健康的两个支柱。小球藻含有丰富的营养成分和保健作用。研究表明小球藻能够增强免疫低下动物的细胞免疫功能，并具有抗脂质血症与抗动脉粥样硬化等生物活性作用[2]。但小球藻对脂代谢及肝脏脂毒性的影响尚有待于进一步的深入研究和探讨。本研究采用有氧运动联合破壁蛋白核小球藻对高脂膳食大鼠进行干预，通过对实验大鼠Lee’s指数，血清、肝脏组织FFA，血清白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、甘油三脂(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)，肝脏白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)含量的比较与分析，探讨有氧运动联合小球藻改善高脂膳食大鼠脂代谢及对肝细胞的保护作用，对于积极、有效地预防和延缓因肥胖导致的代谢性疾病的发生与发展具有重要意义。同时也为蛋白核小球藻的深度开发与利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级55只雄性Wistar大鼠，42 d龄，平均体重(194.13±13.24)g[北京大学医学部实验动物科学部提供，合格证编号SCXK(京)2006-0008]。

1.2 试验用药

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，产自山东滨州，东营倍康生物科技有限公司购得，批号17042807。将已经采用低温高速气流破碎法破壁的蛋白核小球藻(以下简称小球藻)匀质器粉碎后以无菌蒸馏水配制成所需浓度，4℃存放备用。

1.3 主要仪器

STAT FAX 2100全自动酶标仪(美国阿尼朗斯)；FA2004N电子天平(上海精密仪器有限公司)、ALCYON300全自动生化分析仪(美国雅培)；LG 10-3A高速冷冻离心机(北京医用离心机厂)；SHH.W21.Cr600型三用电热恒温水箱(北京市东霞科学仪器厂)；Light Cycler96实时荧光定量PCR仪(瑞士罗氏)。

1.4 动物分组

55只实验大鼠在经过适应性饲养4 d后，进行为期3 d、20 min/d的游泳训练，筛选淘汰5只不适应游泳训练的大鼠后，将剩余的50只大鼠按体重以数字随机分组法分为5组(直接标号法编号)：普通膳食+安静对照组(C组)、高脂膳食+安静对照组(H组)、高脂膳食+小球藻+安静对照组(HC组)、高脂膳食+有氧运动组(HM组)、高脂膳食+有氧运动+小球藻组(HMC)，每组10只。各组大鼠每天自由摄食饮水。C组大鼠以普通饲料(国家标准啃齿类动物饲料，北京大学医学部实验动物科学部提供)常规喂养；其余各组以高脂饲料(60%脂肪热量比饲料，北京博泰宏达生物技术有限公司提供)喂养；HC组和HMC组大鼠每天在训练前半小时采用专业灌胃器灌胃小球藻1次，灌胃剂量为3.9 g/(kg·d)，相当于成人推荐剂量的30倍(预实验确定最佳剂量)，灌胃体积为5 ml/kg，其余各组ig等量生理盐水。实验过程中，严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》规定对待实验用大鼠。实验室室内温度和相对湿度分别控制在(22±2)℃和55%～75%，光照时间随自然变化。HM、HMC组大鼠按照表1的训练方案进行无负重游泳训练[3]，其他组不进行任何运动。大鼠在运动过程中如出现数秒内未迅速浮上水面等疲劳现象，即刻捞出休息5～10 min，待恢复后再继续完成规定训练时间。

Tab. 1 Swimming training program in rats[2](min)

1.5 Lee’s 指数测定

1.6 生化指标测定

ELISA法检测血清IL-6、TNF-α、FFA及肝脏组织FFA、IL-10。GPO-PAP法检测TG、TC，直接法检测HDL-C和LDL-C，以上各指标的测定严格按照试剂盒说明书进行，计算公式等详见试剂盒使用说明书。

各组在末次训练24 h后，禁食(不禁水)12 h，乙醚适度麻醉，从颈总动脉处取5 ml全血。迅速取肝脏置于预冷的4℃生理盐水中充分洗涤以洗净血污，剥掉表面结缔组织的脂肪，滤纸吸干表面水份后置于-20 ℃冰箱保存备用。

组织匀浆制备：精确称取100 mg 肝脏组织，其放入玻璃匀浆管口剪碎。按W(g)组织块重量/V(ml)匀浆介质为1 / 9 的比例加取预冷的匀浆介质(0.9 %的生理盐水)进行匀浆。

血清制备：37℃自然凝固，待血清出现后，放入冰箱24 h后，4℃、3 000 r/min离心10 min，得到的上清液即为血清。

1.7 统计学处理

根据2×2析因设计的方差分析，将H组、HC组、HM组及HMC组大鼠的Lee’s指数、血清和肝脏相关生化指标等数据纳入分析。对于交互作用，检验结果P<0. 05，表明有氧运动和破壁蛋白核小球藻之间存在交互作用。

2 结果

2.1 各组大鼠Lee’s 指数的变化

实验前，各组大鼠Lee’s指数无显著性差异；实验中，各组大鼠Lee’s指数均呈不同程度的升高趋势。至第6周末，与C组比较，H组显著升高(P<0.01)；与H组比较，HC组、HM组、HMC组均显著降低(P<0.05或P<0.01)；与HC组、HM组比较，HMC组均显著性降低(P<0.05，表2)。

2.2 各组大鼠血清及肝脏FFA，血清IL-6、TNF-α，肝脏IL-10含量的变化

至第6周末，血清、肝脏FFA含量，血清IL-6、TNF-α，肝脏IL-10含量，与C组比较，H组均显著升高(P<0.01)；与H组比较，HC、HM、HMC组均显著降低(P<0.05或P<0.01)；与HC组、HM组比较，HMC组均显著降低(P<0.05，表3)。

2.3 各组大鼠血脂的变化

高脂饲料喂养及运动训练、营养干预6周后，与C组比较，H组血清TC、TG、血清LDL-C水平均显著升高(P<0.01)；血清HDL-C水平显著降低(P<0.01)。与H组比较，HC、HM、HMC组血清TC、TG、血清LDL-C水平均显著降低(P<0.05或P< 0.01)，血清HDL-C水平显著升高(P<0.05或P<0.01)；与HC组、HM组比较，HMC组血清TC、TG、血清LDL-C水平均显著降低(P<0.05)；血清HDL-C水平显著升高(P<0.05，表4)。

Tab. 2 Changes of Lee's index of each group n=10)

C: Normal diet +quiet control; H: High fat diet; HC: High fat diet + Chlorella + quiet control; HM: High fat diet + aerobic exercise; HMC： High fat diet + Chlorella +aerobic exercise

*P<0.05，**P<0.01vsgroup C;#P<0.05，##P<0.01vsH;△P<0.05，△△P<0.01vsHMC

Tab. 3 Changes of serum, liver FFA, serum IL-6,TNF-α, liver IL-10 content in rats of each n=10)

C: Normal diet +quiet control; H: High fat diet; HC: High fat diet + Chlorella + quiet control; HM: High fat diet + aerobic exercise; HMC： High fat diet + Chlorella +aerobic exercise

*P<0.05，**P<0.01vsgroup C;#P<0.05，##P<0.01vsH;△P<0.05，△△P<0.01vsHMC

Tab. 4 Changes of blood lipid in rats of each group(mmol/L, n=10)

C: Normal diet +quiet control; H: High fat diet; HC: High fat diet + Chlorella + quiet control; HM: High fat diet + aerobic exercise; HMC： High fat diet + Chlorella +aerobic exercise

*P<0.05，**P<0.01vsgroup C;#P<0.05，##P<0.01vsH;△P<0.05，△△P<0.01vsHMC

3 讨论

当人体日常饮食中摄入的营养物质所提供的能量与自身能量消耗无法收支平衡时，过剩的能量将会以脂肪和糖原的形式贮存于体内。脂肪组织是这部分剩余能量最好的储存位置。但过多的脂肪堆积会造成脂肪细胞体积增大，数量增多。同时，多余的能量超出脂肪组织的贮存容量后，会引发能量的溢出，并以FFA的形式释放进入血液循环系统。当血液中FFA水平超过脂肪组织的储藏和组织对脂肪酸氧化的能力时，过多的FFA就会转入对机体有害的非氧化代谢途径并沉积于心脏 、肝、骨骼肌等非脂肪组织器官。异常增多的FFA具有极强的细胞毒性并可刺激体内脂肪组织释放更多炎症因子，二者的共同作用，进一步扩大炎症反应，可引发组织细胞功能障碍或凋亡，导致脂肪肝等脂代谢疾病的发生[4]。医学上将这一现象称之为“脂毒性”。异常增多的FFA是脂毒性作用的主要因素[5]。同时FFA在非脂肪细胞内会激活非氧化通路脂化为TG，并形成“异位沉积”，对肝脏等非脂肪组织器官造成损伤。TNF-α和IL-6是公认的评价炎症反应的有效指标[6-7]。IL-10则可以通过有效地抑制炎症细胞分泌、产生IL-1、IL-6等多种炎症因子，调节和控制炎症反应，预防和控制炎症损伤的发生与发展，保护组织。Lee’s指数可以作为反映大鼠肥胖程度的良好指标[8]。

实验结果表明H组大鼠由于能量收支不平衡，过剩的能量储存于脂肪组织，脂肪细胞体积及数量均发生改变，出现明显的腹型肥胖及Lee’s指数和血脂升高。增大的脂肪细胞贮存容量和能力有限，脂肪组织代谢分解释放大量FFA进入血液后经循环系统流经门静脉及肝脏时，血液中FFA 水平的急剧升高超过肝脏组织氧化脂肪酸的能力，肝脏组织中FFA水平升高。过多的 FFA转入对机体有害的非氧化代谢途径，刺激体内脂肪组织释放过量的TNF-α、IL-6等炎症因子，并在 FFA 和炎症因子共同作用下，扩大炎症反应，对肝脏细胞产生毒性损害作用。肝脏组织分泌产生大量IL-10以抵御炎症反应。同时异常增多的FFA增加肝脏脂质合成和TG的异位沉积，脂肪细胞葡萄糖转运和TG代谢能力明显降低，大鼠出现脂肪肝和高脂血症。这一结果与其他学者的研究相一致[9]。

HC组采用小球藻对高脂膳食大鼠进行干预，有效地抑制血液及肝脏中FFA浓度的升高和TG代谢能力的降低，增强机体免疫力，降低“脂毒性”作用和相关炎症因子的过量生成和释放，保护肝脏。其机制可能为：(1)小球藻中含有其它微藻所不具有的物质-小球藻生长因子(chlorella growth factor，CGF)。GCF中的糖蛋白具有增强免疫力和促进白血球吞噬细菌的机能。增强免疫力的同时可以有效地降低血清中胆固醇含量[10]。(2)小球藻中含有的多种活性物质(多种维生素(包括维生素C、维生素E)、小球藻多糖、类胡萝卜素)。活性物质可以有效地增强机体免疫能力，阻止集体炎症反应的发生，调解体内代谢的动态平衡的作用，抑制过量FFA对机体特别是肝脏的损伤[11-13]。(3)小球藻中含有的高度不饱和脂肪酸，可以有效地降低血液中TC和LDL-C的含量及血液粘稠度[14]。(4)小球藻可以通过对肝脏内核糖核酸的作用促进机体核蛋白的合成，增强细胞免疫功能，并具有抗脂质血症与抗动脉粥样硬化活性等作用[2]。

HM组采用有氧运动对高脂膳食大鼠进行干预，有效地抑制血液及肝脏中FFA浓度的升高和TG代谢能力的降低，降低“脂毒性”作用和相关炎症因子的过量生成和释放，保护肝脏。其机制可能为：(1)有氧运动可以提高机体能量消耗水平[15]。(2)有氧运动可以有效地加强肌肉组织对FFA、TG等的摄取和利用，减少脂质在非脂肪组织器官上的沉积，降低血脂，预防和控制代谢性疾病[16]。(3)有氧运动可以预防和控制TNF-α、IL-6等炎症因子在脂肪组织的聚集、浸润及脂肪组织炎症因子释放，降低促炎因子在血液循环及组织器官中的数量，缓解炎症应激。而HMC组较单一有氧运动或小球藻干预更为有效。

有氧运动和破壁蛋白核小球藻干预能够不同程度改善高脂膳食大鼠脂代谢，降低肥胖对肝脏造成的脂毒性，保护肝细胞。其中联合干预较单一干预更为有效。本研究对于积极、有效地预防和延缓因肥胖导致的代谢性疾病的发生与发展具有重要意义。同时也为蛋白核小球藻的深度开发与利用提供理论依据。