禽源大肠杆菌的耐药性分析及β-内酰胺类耐药基因的检测

余 蕊,马文杰,高 尚,张清一,鞠辉明,杨跃飞,王彦红

(1.扬州大学兽医学院,江苏 扬州 225009;2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏省人兽共患病学重点实验室,江苏 扬州 225009)

大肠杆菌是临床上细菌性疾病的常见病原,具有较高的发病率和死亡率,给畜牧业带来了巨大的经济损失。因其复杂的血清型,导致现在还没有确切的疫苗可以对大肠杆菌病进行预防,目前主要靠抗菌药物对该病进行控制。随着β-内酰胺类的抗菌药在养殖业的广泛应用,耐药菌株的出现频率也在逐年增长,β-内酰胺酶的产生是细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的主要机制[1]。根据基因型的不同,可以将 β-内酰胺酶大致分为 SHV、TEM、CTX-M、OXA和其他型5种型,其中CTX-M型根据基因序列同源性大于95%被分为5个组群,分别为CTX-M-1群、CTX-M-2群、CTX-M-8群、CTX-M-9群、CTX-M-25群。CTX-M-1群有：CTX-M-1、CTX-M-3、CTX-M-79,等;CTX-M-2 群有 CTX-M-2、CTX-M-4、CTXM-4L,等;CTX-M-9 群有 CTX-M-9、CTXM-14、CTX-M-125,等。随着抗菌药不断地更新换代,CTX-M型的β-内酰胺酶的氨基酸残基不断发生突变,直接影响着酶对抗生素的耐药性[3]。为了解大肠杆菌的耐药情况及β-内酰胺酶的基因型分布现状,我们对5月份门诊送检病科进行了大肠杆菌分离、药敏试验和SHV、TEM、CTX-M-1群、CTX-M-2群、CTX-M-9群基因检测。

1 材料与方法

1.1 病例来源 采集2017年5月扬州大学动物医院畜禽门诊送检病例,这些病例气囊炎、心包炎、肝周炎等病变特征。

1.2 药品与试剂 药敏纸片,TaKaRa LA Taq酶,dNTP Mixture,10X LA PCR BufferⅡ(Mg2+plus),100 bp DNA Ladder,Super GelRed 10 000 Xin Water,10x Ladder Buffer。

1.3 细菌分离 采集的病料接种于麦康凯培养基,37℃培养24 h,挑选单个菌落接种于麦康凯培养基上纯化,并进行生化鉴定。

1.4 药敏试验 采用纸片法分别确认50株分离菌对于复方新诺明、氯霉素、氟苯尼考、链霉素、新霉素、诺氟沙星、庆大霉素、丁胺卡那霉素、头孢曲松、多西环素、左氧氟沙星、多黏菌素、妥布霉素、美洛西林、卡那霉素15种药物的耐药情况。

1.5 DNA模板的制备 采用煮沸法制备细菌模板,将细菌无菌放置于事先高压灭菌的装有超纯水的指形管中,指形管放入沸水中加热8～10 min,-20℃保存。

1.6 PCR扩增耐药基因 根据参考文献[3],在上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物(表1)。DNA模板预变性95℃加热5 min,其中94℃变性1 min,退火温度加热1 min,72℃延伸1 min,32次循环,最后72℃再延伸10 min。PCR产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳,观察结果。出现预期大小的扩增产物送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序,比较分析,判断产物具体的基因型。

表1 PCR扩增引物

2 结果

2.1 细菌分离 2017年5月份病料在麦康凯培养基上生长呈粉红色,并进行生化鉴定,共分离鉴定出50株大肠杆菌。

2.2 药敏试验 50株分离菌对复方新诺明、氟苯尼考、多西环素、链霉素、卡那霉素的耐药率较高,其中对复方新诺明的耐药率高达82%,对常用药氟苯尼考和多西环素的耐药率分别为60%和64%,β-内酰胺类的抗生素美洛西林和头孢曲松的耐药率较低,分别为26%和20%。菌株的耐药情况见表2。

表2 50株分离菌株的耐药情况

2.3 PCR 检测 TEM、CTX-M-1、CTX-M-2 和CTX-M-9和SHV 5种基因50株分离菌经PCR扩增后均未检测到SHV型及CTX-M-2群基因。PCR扩增TEM型基因,出现约900 bp的条带,与预期大小833 bp相近(见图1),将样品测序结果上传GenBank,Blast所测基因。50株大肠杆菌有23株检测到此基因。此外,PCR扩增CTX-M-1型和CTX-M-9型,出现预期大小的条带833 bp(见图2)和863 bp(见图3),将样品测序结果上传Gen-Bank,Blast后2株细菌的CTX-M-1型阳性产物序列均为CTX-M-79,5株细菌的CTX-M-9型分别为4株CTX-M-14,1株CTX-M-125。根据检测结果发现有3株细菌含有至少含有2种β-内酰胺类耐药基因,其中2株含有CTX-M-79的菌株均含有TEM基因(见表3)。

图1 TEM型基因PCR检测结果

图2 CTX-M-1型基因电泳结果

图3 CTX-M-9型基因电泳结果

表3 基因检测阳性结果

3 讨论

从本试验的结果可以看出,临床分离出的菌株对于磺胺类药物耐药性相当高,其中对复方新诺明的耐药率甚至高达82%,对β-内酰胺类抗生素—美洛西林及头孢曲松的耐药率也较高。耐药菌株出现的概率如此之高,其原因有很多种,主要是食用动物的饲养中抗生素的滥用。近几年来我国流行的β内酰胺酶耐药基因的种类主要是SHV、TEM、CTX-M型[4]。已有的文献中动物源性大肠杆菌SHV的检测为37.7%[5],而在2017年兰芳俊等研究中发现人类医院中存在的大肠杆菌未检测出SHV型[6],同样,在本研究的50株禽源大肠杆菌未发现SHV型。TEM是主要流行β内酰胺酶耐药基因,此基因在50株禽源大肠杆菌的检测率为46%(23/50),与近几年的研究结果相一致[5、7]。

大肠杆菌中常存在CTX-M型,并且经研究发现不同组群的CTX-M型对不同抗生素的耐药效果存在显著的差异[2、8-10]。而出现变化的在于具体的基因亚型,近年来中国地区流行的主要是CTXM-14、CTX-M-15 和 CTX-M-55[2、11],而在本研究中,2017年5月份从扬州及周边地区所分离的禽源大肠杆菌未检测CTX-M-15及CTX-M-55,主要出现的是CTX-M-14和CTX-M-79,还出现少量CTX-M-125。此外,根据CTX-M型检测结果和兰芳俊的研究结果相类似,均检出CTXM-1型和CTX-M-9型,而未检出CTX-M-2 型[6]。

抗生素耐药性中存在的巨大时间和地域差异可能是因为在生产实践和临床治疗中,可能是由于不同的医生、不同时期及不同地区使用抗生素种类及剂量的差异所导致的。细菌高耐药性的现状提示我们,在药物的合理使用方面还存在欠缺,在临床用药时,我们可以根据药敏试验结果,合理选择抗生素,不可长期大量使用同一种抗生素,避免耐药细菌特别是超级细菌的大量出现。