日粮纤维对吉林白鹅免疫器官指数和肠道黏膜微生物多样性的影响

周海柱,郭 玮,王东印,高云航,徐 博,滕战伟,陶大鹏,勾长龙,娄玉杰

(1.吉林农业大学动物科学技术学院,吉林 长春 130118;2.吉林省科技创新平台管理中心,吉林 长春 130012)

鹅为我国的传统家禽,其具有抗逆性强、养殖成本低、收益高的特点。鹅能够采食纤维是因为其具有发达的盲肠,且盲肠中含大量的微生物,微生物能够将纤维进行发酵降解供宿主和自身利用。研究表明,鹅盲肠的环境温度和pH值适宜,适合微生物生存,正是由于这些微生物酶解作用将纤维素分解[1-2]。肠道微生物和宿主之间的关系是科研工作者的关注热点。李彦品研究指出,2.5%低纤维饲粮降低了仔鹅的蛋白和能量的利用率,降低了盲肠微生物的多样性[3]。肠道微生物对致病菌的繁殖具有抑制作用,定植在肠黏膜上的微生物能够防止病原微生物和毒物进入体内,起到了屏障作用[4]。目前,对鹅肠道黏膜定植菌种类的研究尚未形成一定的系统,关于纤维对鹅肠道黏膜定植菌的研究鲜有报道。本试验通过研究不同水平及来源的纤维对鹅免疫性能、肠道黏膜定植菌的影响,为揭示鹅肠道黏膜细菌定植规律提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物与分组 选取体重均匀、健康的5周龄的吉林白鹅80只,随机分为4个试验组,每组20只。分组见表1。

1.2 饲养管理 试验鹅在吉林农业大学养殖基地进行饲养,每天早晚各饲喂一次,严格控制饲养环境,按照正常的饲养管理和免疫程序进行饲养。试验期为35 d。

1.3 试验日粮组成与营养价值 依据等能、等蛋白原则,参照NRC(1994)和我国营养价值表(2007)配制。日粮配方见表1。

表1 日粮配方及营养成分 /%

1.4 测定指标及方法

1.4.1 免疫器官指数 饲养结束后,每个处理随机选取5只鹅进行试验,称重后屠宰。取出胸腺、腔上囊、脾脏,去除附属组织后进行称重并计算器官指数。计算公式如下：

1.4.2 肠道黏膜采集测定 屠宰后,对十二指肠、空肠、回肠、盲肠进行结扎,酒精擦拭消毒后在无菌超净台将肠段剪开,生理盐水冲洗,用灭菌手术刀片刮取肠道黏膜,存入2 mL冻存管,液氮快速冷冻后,置于-80℃冰箱中待检。采用PCR-DGGE技术对鹅肠道黏膜定植菌进行测定。

1.5 数据处理与统计分析 试验数据采用Excel 2010软件进行初步整理,采用SPSS 18.0进行多重比较分析,数据采用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 日粮纤维对吉林白鹅免疫器官指数的影响由表2可知,随着日粮纤维水平的提高,II组和IV组的胸腺指数和脾脏指数均比I组和III组显著提高(P＜0.05);腔上囊指数有提升趋势,但差异不显著(P＞0.05)

在相同纤维水平的条件下,II组和IV组的胸腺指数分别为0.32%、0.23%,差异性显著(P＜0.05)。其余各组均无显著性差异(P＞0.05)。

表2 免疫器官指数测定结果 /%

2.2 肠道黏膜PCR-DGGE指纹图谱和微生物多样性分析 由图1可知,各组各肠段肠黏膜定植微生物的含量和多样性。通过表3及图2可知,随纤维水平升高,各肠段黏膜定植菌的丰度、多样性指数也随之上升;在同一纤维水平下,I组微生物丰度、多样性指数要小于III组,II组微生物丰度小于IV;各组各肠段黏膜定植菌种类均匀。

图1 肠道黏膜定植微生物PCR-DGGE指纹图谱

图2 肠道黏膜PCR-DGGE电泳丰度

由表4可知,I组和II组回肠相似性指数为35.6%,相似性最小,表明I组和II组间的回肠微生物差异性最大,纤维水平的提高,对回肠黏膜微生物的多样性具有较大影响;III组和IV组相比,其十二指肠微生物相似性指数最小,表明两组间十二指肠黏膜微生物差异性最大,日粮纤维水平对十二指肠黏膜定植菌群多样性影响最大。

在同一日粮纤维水平下,I组与III组相比,回肠黏膜相似性指数为50.4%;II组和IV组相比,回肠黏膜相似性指数为46.5%。

表3 肠道黏膜微生物丰度、多样性指数和均匀度

表4 I、II、III、IV组各肠段黏膜微生物相似性指数分析 /%

2.3 肠道黏膜PCR-DGGE指纹图谱的聚类分析

图3 吉林白鹅肠道黏膜PCR-DGGE指纹图谱聚类分析

从图3可以看出,I各组各肠段黏膜之间微生相似程度均较低,各样品之间的菌群差异性较大,但仍有共同菌,并且不同来源及不同水平的纤维对各肠段黏膜定植微生物结构变化具有一定的影响。

2.4 肠道黏膜PCR-DGGE指纹图谱差异性条带与共性条带测序结果分析 依据肠道黏膜PCR-DGGE指纹图谱,将差异性条带、共性条带共16个进行切胶回收。对回收的条带进行克隆测序,用GenBank对结果进行比对,结果见表5,其中相似度达到99%以上的条带有9个,达到98%以上的条带有2个。幽门螺杆菌(Helicobacter cetorum)和大肠杆菌(MC)广泛的寄存在各肠段黏膜中,戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)主要寄存在回肠黏膜,Peptoclostridium difficile、梭状芽孢杆菌(DSM)主要寄存空肠、回肠、盲肠黏膜中,核酸杆菌主要存在于回肠、盲肠黏膜中,瘤胃球菌属(Ruminococcus obeum)主要存在于盲肠黏膜中,空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)广泛存在于回肠黏膜中。

表5 肠道黏膜PCR-DGGE指纹图谱差异性条带与共性条带测序结果

3 讨论

3.1 日粮纤维对吉林白鹅免疫器官指数的影响 随着日粮纤维水平的提高,鹅脾脏、胸腺及腔上囊等免疫器官指数均显著的升高[5]。本试验表明,随着日粮纤维水平的提高,I组与II组、III组与IV组之间的胸腺指数、脾脏指数增加,差异显著,说明日粮适宜的纤维水平能够提高鹅机体免疫力。胡敏华[6]等研究肉鹅日粮不同的纤维水平(5.03% ～10.98%)对免疫功能的影响,发现各处理组间脾脏指数差异显著,且纤维水平为6.97%时达最高值,日粮中适量的添加纤维可以提高肉鹅的免疫功能,与本试验结果一致。

3.2 日粮纤维对吉林白鹅肠道黏膜微生物多样性的影响 肠道内的微生物对鹅的营养代谢、免疫功能至关重要。日粮组成能够影响肠道中微生物分布与数量的变化[7-8]。日粮纤维可以改变鹅肠道黏膜菌群的多样性和丰度且不同肠段菌群结构变化不同[5]。本试验研究表明,提高日粮的纤维水平,各肠段黏膜的微生物的含量及其多样性指数也随之升高;同一纤维水平,秸秆组各肠段黏膜定植菌群丰度和多样性与苜蓿组相比较低。通过比较相似性指数可以看出,秸秆处理组回肠黏膜相似性指数最小,苜蓿处理组十二指肠相似度最小,表明纤维水平的不同对秸秆组的回肠及苜蓿组的十二指肠黏膜菌群结构影响最大。在相同纤维水平下,各组回肠黏膜相似性指数最小,证明饲喂苜蓿对于提高回肠黏膜微生物多样性影响最大。聚类分析表明不同肠段之间相似度均较低,样品间的差异性较大,但仍存在共同菌。

代文婷[9]研究表明,在牛瘤胃壁上附着的菌群中有22.4%为拟杆菌属,11%为瘤胃球菌属,脱硫杆菌属占4%。Sadet[10]等研究发现,羊瘤胃壁黏膜粘附菌其中就有拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)。

本试验通过克隆测序研究发现,各肠段黏膜中广泛的寄存着幽门螺杆菌(Helicobacter cetorum)、大肠杆菌(Escherichia coli),能够分解肠道中纤维素的瘤胃球菌属(Ruminococcus obeum)广泛定植于盲肠黏膜,而梭状芽孢杆菌属(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)为纤维素分解菌的一种,其定植于空肠、回肠、盲肠黏膜,戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)能够分解碳水化合物主要定植于回肠黏膜。日粮纤维水平的不同能够对瘤胃球菌属、梭状芽孢杆菌属、戊糖片球菌属定植数量产生影响,与罗旭[11]研究结果一致。

4 结论

4.1 随着日粮纤维水平的提高,吉林白鹅胸腺指数、脾脏指数显著增加,腔上囊指数有增长趋势。

4.2 随日粮纤维水平的提高,吉林白鹅十二指肠、空肠、回肠、盲肠黏膜定植微生物多样性提高,其中优势菌瘤胃球菌属、梭状芽孢杆菌属、戊糖片球菌数量增加,对纤维有分解能力的菌群出现了不同程度的增加。