羊猝狙的多重PCR诊断及病原分离株生物学特性试验

李生庆,张西云,黄 荣,刘怀新,河生德,祁 果,胡国元,王亭亭,李积良

(1.青海大学畜牧兽医科学院,青海 西宁 810016;2.青海省海晏县兽医站,青海 海晏 810018;3.青海省祁连县野牛沟乡畜牧兽医站,青海 祁连 810400)

2017年7月,青海省海北州海晏县青海湖乡德吉村牧民养殖的羊发生急性死亡,临床症状表现为病羊出现腹胀严重,并在2 h内死亡 ,其他无明显特征。剖检心、肝、脾、肾、肺无明显病理变化,小肠出血明显,部分肠段呈血红色,回盲口、盲肠大面积出血。截止送检,已死亡羊17只,造成较大经济损失。根据临床症状,该地区疫病发生流行病学状况,初步怀疑此次疫病由产气荚膜梭菌引起。

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens),是引起畜禽猝死症、坏死性肠炎、肠毒血症、气性坏疽的主要致病菌[1]。 该菌分 A、B、C、D、E 5个不同的菌型[2],致病性主要与其毒素有关,其产生的毒素共有12种。其中α毒素是由一种5个菌型均产生的坏死、致死性毒素,有人认为其是 家畜“猝死症”的主要致病因子[3-4]。由产气荚膜梭菌引起的羊猝死症,主要发生于羊的毒血症,包括羊猝狙、羊肠毒血症、羔羊痢疾等。由于产气荚膜梭菌为土壤常在菌,病原菌随饲料和饮水被羊食入,可长期存在于肠道中,当消化道机能受到损坏时,病原菌迅速繁殖并产生大量毒素,从而使羊发病死亡,因此,很难在胃肠道之外的其他脏器内分离到病原菌,这给该病的诊断工作增加了难度。

鉴于此,我们根据产气荚膜梭菌所产毒素不同,设计具有特异性的扩增引物,进行了PCR诊断,并结合实验室常规诊断,确定此次疫病是由C型产气荚膜梭菌引起的羊瘁疽。此次诊断中,利用产气荚膜梭菌所产的α、β、ε三种主要毒素,建立的产气荚膜梭菌多重PCR方法,可在很大程度上降低诊断的难度,并可节省时间,提高疫病诊断的精确性。

1 材料

1.1 病料来源：2017年7月,由青海省海北州海晏县青海湖达玉乡德吉村牧民送检的病死羊心、肝、脾、肾、肺脏及部分肠段。

1.2 标准菌株：C型产气荚膜梭菌标准菌株(721株),购自中国兽医药品监察所微生物室,腐败梭菌(FB2010株)、B型诺维氏梭菌(TB05株)、D型肉毒梭菌 (D8901株)、B、D型产气荚膜梭菌(乌B1株、C602株)菌株均为本实验室分离保存菌株。

1.3 培养基的制备：血液琼脂、厌气肝汤两种培养基均按常规制备,121℃灭菌40 min,4℃保存备用。

1.4 试剂：TaqDNA聚合酶、10×PCR缓冲液、dNTP(10 Mmol/L)、25 mmol/L的MgCl,均购自北京博迈德科技发展有限公司;琼脂糖为Biowest产品;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 试验动物：18～22 g昆明系小鼠,购自青海省地方病研究所。

2 方法

2.1 病原分离

2.1.1 组织摸片、镜检：将送检羊心、肝、脾、肾、肺脏等脏器触片,革兰染色,镜检。

2.1.2 脏器培养：将送检羊心、肝、脾、肾、肺脏等脏器接种于普通琼脂斜面、普通肉汤、厌气肝汤等培养基中37℃培养24 h。

2.1.3 肠内容培养：取病死羊肠道逐段抹片镜检,接种疑似菌密度较大肠段的内容物于加有新鲜生肝块的厌气肝汤37℃培养24 h,将该培养物接种于鲜血琼脂平板上,挑取疑似菌落,得到纯培养物;也可直接用肠内容物划线接种于鲜血琼脂平板,挑取疑似菌落。

2.2 动物试验

2.2.1 肠内容物毒素测定 将病死羊的回肠内容物1 mL加入9 mL生理盐水中,充分混匀后5000 r/min离心30 min,吸取上清液,用生理盐水作适当稀释后,在可能的毒力范围内静脉注射小鼠,每一滴度注射2只,0.2 mL/只,观察记录小鼠死亡情况,确定小鼠最小致死量。

2.2.2 分离菌株产毒测定 血平板上培养24～48 h后,挑取平板上溶血特征明显的单个菌落于VF厌气肝汤培养基中,37℃培养24 h,吸取纯培养2 mL 2管,其中1管4 000 r/min离心30 min,另1管中加入2 mL含2.5 g/L胰酶的10 g/L的碳酸钠溶液2 mL,37℃活化50 min后,用生理盐水倍比稀释,每一滴度静脉注射小鼠2只,0.2 mL/只,观察记录小鼠发病、死亡情况,确定小鼠最小致死量。

2.3 C型产气荚膜梭菌的多重PCR检测

2.3.1 DNA模板的制备 将纯化的分离待检菌和标准阳性产气荚膜梭菌分别接种于鲜血平板,37℃厌氧培养24 h,挑取单个菌落3～4个至装有0.5 mL蒸馏水的Doff管中,震荡混匀,12 000 r/min离心1 min,弃去上清液,用1×PBS缓冲液200 μL悬浮菌体,13000 r/min离心1 min,弃上清后加入200 μL 1×PBS液重悬,混匀后加入蛋白酶K 20 μL,再加200 μL CB结合液,混匀后,70℃水浴放置10 min.取出冷却后加100 μL异丙醇,混匀。利用博迈德科技发展有限公司研制的组织/细胞DNA提取试剂盒提取DNA.提取物于4℃冰箱保存备用。

2.3.2 引物设计 根据GenBank中报道的产气荚膜梭菌基因序列及相关的参考文献[1～4],分别在α毒素和ε毒素的保守区域设计2对引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列如下：

α 毒素：上游引物：5′-CACGATGTATCAGAGGGTA-3′;

下游引物：5′-TAAGTGTCTTTGCTTCCAG-3′;

预期扩增片段大小：325 bp;

β 毒素：上游引物：5′-GCGAATATGCTGAATCATCTA-3′;

下游引物：5′-GCAGGAACATTTAGTATATCTTC-3′;

预期扩增片段大小：236 bp;

ε 毒素：上游引物：5′-GTATCTAATGAAATGTCCA-3′;

下游引物：5′-CTTCCACTTACTTGTCCTAC-3′;预期扩增片段大小：585 bp。

2.3.3 PCR扩增反应体系 PCR反应总体系为25 μL：10 × Buffer缓冲液 2.5 μL,10 mmol/LdNTP 1.0 μL,上下游引物各 0.5 μL,模板 DNA 5.0 μL,Taq DNA 聚合酶 0.5 μL,灭菌双蒸水 14 μL。

反应程序为：96℃预变性20 min,然后94℃变性30 s,51℃延伸40 s,72℃复性1 min,共循环30次,最后在72℃延伸10 min。

2.3.4 PCR产物电泳 PCR反应结束后取5 μL产物在1.2%的琼脂糖凝胶中电泳120 V,20 min,紫外灯下观察并拍照,分析PCR扩增结果。

2.3.5 PCR检测的特异性试验 分别以C型产气荚膜梭菌标准株(721株)为阳性对照,以乳酸大肠杆菌、D型肉毒梭菌、腐败梭菌、D型产气荚膜梭菌、B型诺维氏梭菌等作为阴性对照,检测PCR反应的特异性。

3 结果

3.1 组织触片镜检 送检各脏器触片,革兰染色后镜检,均未未见到有疑似产气荚膜梭菌存在,不同肠段摸片,革兰染色镜检,可见有革兰阳性、两端钝圆的大杆菌。

3.2 分离菌的形态与培养特性 小肠内容物在厌气肝汤培养基中培养24 h后涂片,见到两端钝圆的大杆菌;在鲜血琼脂平板上厌气培养24 h开始生长,48 h可见圆形略隆起、灰白色半透明的菌落,菌落周围有溶血环,涂片镜检可见与肠内容物涂片相同的细菌(见图1,2)。

图1 菌落形态

图2 平板溶血特性

3.3 动物试验结果 分别从4个肠段血平板培养基上挑取菌落形态大小、溶血不一的菌落,接种于VF厌气肝汤中,37℃培养24 h,经胰酶活化和未活化培养物离心后,上清经稀释后测毒,经胰酶活化后,所有菌株培养物均未致死小鼠,未活化菌株培养物测得其小鼠最小致死量分别为50～1 000 MLD/mL(见图3)。

图3 不同菌株产毒能力对比

3.4 PCR扩增结果 利用合成的2种引物进行PCR扩增,标准菌株C602和分离菌株都扩增出大小为325 bp的α毒素及236 bp的β毒素的目的条带,结果如图4。

图4 产气荚膜梭菌分离株PCR扩增

3.5 特异性试验 在相同条件下,只有标准菌株和两株分离菌扩增出大小325 bp的α毒素及585 bp的ε毒素相应条带,其他腐败梭菌、乳酸大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均未扩增出上述条带,表明该试验结果具有很好的特异性。结果如图5。

图5 特异性扩增结果

4 讨论

4.1 产气荚膜梭菌广泛分布于土壤、污水、饲料、粪便以及动物肠道中。若饲养管理不当、气候变化等诸多因素改变极易诱发绵羊和山羊发病,引起羊肠毒血症、羊猝狙、羔羊痢疾等,导致发病动物急性死亡[5]。因此,经常看不到特征症状即发生死亡,虽然可以初步怀疑是由产气荚膜梭菌引起的疫病,但若要得到确切的结果,就必须分离到菌株,且进行血清型鉴别,才能确诊。由于该菌是由肠道毒素引起的动物急性死亡,故在脏器内一般分不到病原菌,而从肠道内分离致病菌株尤其麻烦。另外,只有得到确切的分型结果,才能指导牧户正确使用疫苗进行全群预防,防治疫病的继续发生。因此建立产气荚膜梭菌的快速诊断方法,对于疫病的诊断、检测以及预防具有重大的意义。

4.2 此次病死羊的诊断过程中,我们从不同肠段分离到产毒能力不一的菌株11株,以往的试验中,一般在同一肠段的培养基上挑取1～2个典型、单个菌落进行培养,测毒分析,然而,此次试验结果证明,同一肠段上的不同菌落在同一培养条件下的产毒能力有较大区别,此次试验中,1号结肠段,共分离出5株菌,毒力最低的为100 MLD/mL,最高的达1 000 MLD/mL,回肠4号肠断共分出3株菌,毒力最低的为50 MLD/mL,最高的达1 000 MLD/mL,2号结肠段共分离出3株菌,毒力在500-1 000 MLD/ml之间。因此,在进行病原菌毒力分析时,尽可能多挑菌落,才能选出致病性较高的菌株,作为疫苗生产的备用菌株。另外,如果挑选菌落太少,找不到致病性病原菌,就会对疫病的诊断结果产生较大影响。

4.3 随着分子生物学研究的发展,许多产气荚膜梭菌新的定型方法相继出现,比如基因芯片和酶联免疫吸附试验(ELISA)[6]等。目前,国内外利用PCR方法扩增产气荚膜梭菌不同毒素完成病原检测的比较多[7]。早期常经过单独扩增每个主要致死毒素基因(4～5次)才能完成病原分离株的定型[8]。多重PCR具有很高的敏感度和特异性,从而实现高效率、短周期、低成本的检测目的[9]。本试验依据产气荚膜梭菌不同血清型产毒素种类的差异,利用多重PCR方法,对分离株进行鉴别诊断,得到的结果与实验室诊断结果相一致,证明该方法对于建立产气荚膜梭菌的快速诊断方法具有指导意义。