浅谈兔肠致病性大肠杆菌和魏氏梭菌毒力基因的快速检测

2018-02-14

畜禽业 2018年10期

(贵州省畜牧兽医研究所，贵州贵阳 550005)

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

实验采用的样品为某中型肉兔场的病兔与死兔的肠内容物、粪便样品以及兔舍附近的尘土样品，一共采集135份实验样品；实验采用的菌种为产气夹杆菌A型以及肠致病性大肠杆菌；实验采用的试剂包括Taq DNA聚合酶、电泳级琼脂糖以及无水乙醇等常规化学试剂；实验采用的菌培养基为麦康凯琼脂培养基以及葡萄糖绵羊血琼脂培养基。

1.2 实验方法

1.2.1 菌的分离培养

称取10 g样品进行预处理，并将其放置于90 mL 0.5%的缓冲蛋白胨水中，振荡摇匀之后，将样品液接种于普通营养肉汤中，在37℃需氧以及42℃厌氧条件下过夜培养。在过夜培养之后，将37℃需氧培养获得的样品接种于麦康凯平板上，继续放置于37℃需氧条件下，培养24 h之后，使用生理盐水将平板上培养的菌落(粉红色)洗脱收集；将42℃厌氧培养获得的样品接种于葡萄糖绵羊血琼脂培养基，继续放置于42℃厌氧条件下，培养时间控制在24～48 h，使用生理盐水将培养基中的菌落(草绿色)洗脱收集。将获得的两种菌体进行混合离心处理，并添加适量的双蒸水备用[1]。

1.2.2 检测样品的制备

吸取1 mL的菌体混合物，在12 000 r/min的转速下离心30 s，将上清液去除之后添加100 μL的灭菌去离子水或者PCR缓冲液，煮沸10 min后在12 000 r/min的转速下离心30 s，选取上清液进行PCR扩增。

1.2.3 PCR试验

(1)引物设计，通过DNAstar软件进行PCR试验引物的设计。其中，兔肠致病性大肠杆菌的引物位于eae A基因上，其扩增片段为833bp；魏氏梭菌的引物在α毒素基因上，其扩增片段为324bp。

(2)PCR反应体系，在PCR试验过程中，总反应体系为50 μL。包括10 μL的10×PCR buffer；5 μL的2.5mol/L dNTP；5 μL的模板；1.4 μL的23umol/L eae A引物；2.0 μL的αtoxin；0.3 μL的5 U/μL Taq酶。在添加上述反应物之后，添加适量的三蒸水至50 μL。PCR试验的循环参数为：在94℃的条件下进行5 min的预变性，并进行30 s的变性；在56℃的条件下退火30 s；在72℃的条件下延伸1 min；在经过30个上述循环之后，在72℃的条件下反应10 min。

(3)产物分析，在PCR反应完成之后，选择10 μL的二重PCR产物，添加2 μL的加样缓冲液，浆混合液放置于1.0%的琼脂糖凝胶中，在90 V恒压的条件下电泳，利用数字图像分析仪进行观察与拍摄，并将DL2000DNA Marker作为分子量参照物，进行实验结果的记录。

2 实验结果

实验结果显示，病兔和死兔肠内容物、粪便中含有大量的肠致病性大肠杆菌以及魏氏梭菌，两者可以同时存在，也可以单独存在；兔舍的饲料、饮水和生活污水中含有一定量的肠致病性大肠杆菌以及魏氏梭菌；在兔舍的尘土中，舍内尘土中的肠致病性大肠杆菌的含量最高、舍外尘土及较远距离的尘土中肠致病性大肠杆菌的含量逐渐降低；兔舍尘土中的魏氏梭菌含量较少，而且不存在明显变化。由此可以看出，在进行肉兔养殖的过程中，不仅需要按照标准流程做好免疫工作，还需要保障兔舍的卫生，避免兔舍外的污染物进入到舍内，防止肉兔出现腹泻病。