豆豉纤溶酶的研究进展

◎ 高 洋，孙 艳

（漯河食品职业学院，河南 漯河 462300）

豆豉是一种常见的大豆发酵制品。大豆中除含有优质的植物蛋白质、矿物质外，还含有一定的生理活性物质，如大豆异黄酮、大豆低聚糖、大豆皂苷及大豆磷脂等。经过发酵制备的豆豉，其蛋白质、矿物质（钙、铁）、维生素（B2、PP、E）、纤维素含量均有明显的提高[1]。在发酵过程中会产出一种活性较高的酶，称为豆豉纤溶酶，这种酶不但具有较强的溶解能力，而且安全，对人体无毒害作用，不会引起内出血，可以有效预防血栓的形成[2]，这对于血栓病保健食品的开发，具有重要意义。

1 豆豉纤溶酶的功能特性

1.1 溶血栓特性

为了探究豆豉纤溶酶是否具有体外溶栓作用，李江伟等[3]用豆豉纤溶酶、尿激酶进行体外试验。在相同试验条件下，比较两种物质对血块的溶解速率，发现作用2 h后，豆豉纤溶酶血块溶解率大于50%，尿激酶血块溶解率为45%；作用6 h后，豆豉纤溶酶血块溶解率为100%，尿激酶血块溶解率为75%。由此可见，在体外豆豉纤溶酶比尿激酶的溶栓效果更好。

为了验证将豆豉纤溶酶作用于体内是否也具有较好的溶栓效果，刘宇峰[4]以家兔为对象，分别用豆豉纤溶酶、尿激酶和蚯蚓激酶进行体内试，结果表明：尿激酶对家兔体内的动脉血栓无任何作用；蚯蚓激酶剂量为150 mg/kg时，对家兔体内的动脉血栓亦无抑栓、溶栓作用；而豆豉纤溶酶剂量为150～300 mg/kg时，具有明显的抑制动脉血栓形成及溶解血栓作用。同时，他还对豆豉纤溶酶的安全性进行了试验，研究发现，对多组家兔灌胃0.05～0.8 g/mL的豆豉纤溶酶时，均无明显毒性表现，说明了豆豉纤溶酶的安全性。

1.2 抗氧化性

人体内的氧化离不开人体和食物中的氧自由基和其他种类的氧原子。这些自由基可以和人体组织、细胞中的氧化活性分子发生反应，导致氧化损伤。豆豉中存在较多的抗氧化物质，这些物质的抗氧化活性显著高于未经发酵的大豆。段智变等[5]从纳豆中得到一些粗提物，并进行试验。研究发现，这些粗提物可以降低机体血清中低密度脂蛋白胆固醇的含量，提高抗氧化酶SOD的活性，从而增强机体的抗氧化作用，减少细胞的氧化损伤。

1.3 降血脂特性

血液中的脂类主要有胆固醇、甘油三酯、磷脂、游离脂肪酸等，其中胆固醇、甘油三酯为疏水性物质，不能在体内直接转运，也不能被组织细胞直接作用，必须与特殊的蛋白和极性类脂（如磷脂）形成亲水性的脂蛋白，才能在机体内运输，并进入细胞，在正常情况下，人体血脂的合成、分解处于动态平衡之中。血脂过多，会沉积在血管壁上阻塞血管，引发血栓、动脉粥样硬化等疾病。而在脂蛋白的代谢中，有两种非常重要的蛋白质——低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL），分别有促进、减缓脂蛋白合成的作用，所以控制高血脂症的关键在于促进机体HDL的生成。为了研究豆豉纤溶酶与降血脂之间的关系，袁淑云[6]对正常小鼠进行试验，将小鼠分为正常组和对照组，试验组喂食纳豆激酶粗提液，在相同条件下，观察小鼠血脂的变化情况，结果发现，8%的纳豆激酶比正常对照组，使小鼠血清中胆固醇减少了0.54 mg/mL，因此，纳豆激酶粗提液在高脂饮食诱发的小鼠高脂血症过程中有阻止胆固醇升高的作用。

2 豆豉纤溶酶的制备工艺研究

豆豉纤溶酶的制备包括发酵菌种的筛选、发酵、分离纯化3个关键工艺。

2.1 菌种的筛选

大量的研究表明，产出豆豉纤溶酶的菌种为枯草芽孢杆菌。董明盛[7]等从豆豉中分离得到豆豉纤溶酶，产酶菌株为枯草芽孢杆菌，其产酶活力达到683.3 U/mL。中国科学院的韩润林[8]从豆豉中分离得到1株高产纤溶酶的枯草芽孢杆菌菌株，纯酶的比活力达到9800 U/mg，活性回收率为63．8%。东北林业大学的王开敏[9]从豆豉中分离到1株有纤溶酶活性的菌种，经鉴定为枯草芽孢杆菌，并对该菌株的产纤溶酶基因进行克隆表达，得到了能发酵产胞外纤溶酶的重组体。

2.2 豆豉纤溶酶的发酵

传统的豆豉纤溶酶发酵工艺可分为固体发酵和液体发酵两大类。固体发酵是先将大豆煮熟，接种上相应的菌种，培养后即可得到豆豉纤溶酶，此种方法操作简单、周期短、生产成本低。而液体发酵则是在液体培养基的环境下，接上菌种进行发酵的方法。液体发酵的条件更易控制，适合工业化的大规模生产，是目前生产豆豉纤溶酶的主要发酵方法。

近年来，又发现了一种新的发酵技术——双水相发酵，其中菌体底物为一相，产物为一相，该种方法能将发酵过程中的生物转化与分离相结合，与传统的发酵手段相比，更快速、简便，而且还能解除发酵产物中的反馈抑制现象，生成的物质稳定、成本更为低廉，适合工业上的连续生产。

同时，也能利用生物克隆技术获得豆豉纤溶酶。张少平等[10]利用生物克隆技术将原豆豉纤溶酶的DNA片段复制克隆到载体pET32a中，并将这样的重组体转入到大肠杆菌中，以此在大肠杆菌内获得豆豉纤溶酶蛋白酶。Liang等[11]利用Lactococcus lactis菌株，将NK的片段基因导入其中，从而成功获得了豆豉纤溶酶的受体菌株。

2.3 豆豉纤溶酶的分离纯化

豆豉纤溶酶进行分离纯化的关键是保证酶的活性、纯度及得率，同时，由于纤溶酶的热敏感性，导致极易发生自溶现象[12]，其在进行分离纯化时，整个过程通常会处于低温状态下。此外，由于微生物可以分解豆豉纤溶酶，其整个分离纯化过程还应注意其他菌种的污染，避免造成分离后的豆豉纤溶酶活力不稳定[13]。

目前，豆豉纤溶酶的分离纯化方法主要有硫酸铵沉淀法、超滤、凝胶过滤、层析等。王金英等[14]人利用硫酸铵沉淀法实现了豆豉纤溶酶的分离纯化，其前处理为将豆豉加入到一定比例的生理盐水中，放置于10 ℃的环境下不断搅拌10 h，之后使用离心机进行离心，将离心后的上清液装入特定的容器中，再加入硫酸铵至饱和度60%，使用搅拌器将改溶液搅拌均匀，在2～8 ℃的环境下放置10 h。之后进行离心，将离心后的底部沉淀，过透析脱盐，再对溶液进行离心，所得上清液就是豆豉纤溶酶的粗酶液。

李江伟等[15]利用层析方法对豆豉纤溶酶进行分离纯化，其前处理为将豆豉制备成冻干品，之后使用磷酸盐缓冲液进行酸碱调节使溶液中的pH为7.4，再过Sephadex G-100层析柱，并使用该磷酸盐缓冲液对层析部分进行冲洗280 nm处，并进行收集。以此来获得豆豉纤溶酶的粗酶液。

韩润林等利用超滤对豆豉纤溶酶进行了分离纯化。其前处理为先将豆豉发酵液进行去除杂菌，再加入无水CaCl2，维持pH为6.6，之后进行离心处理，获取上清液。将所得的上清液进行超滤脱盐处理得到浓缩液，并对其进行层析分离。之后再对活性部分进行沉淀、离心、层析处理，获取其活性部分，即为溶栓酶。对其进行酶活力的测定，发现其均有较高的酶活。

3 豆豉纤溶酶的应用前景

目前，功能性食品作为新兴产业，其自身的功能作用越来越受到大众的关注，并且随着现代人保健意识的提高，对于食疗好于药疗的观念在逐渐增强，这些功能性食品也逐渐走进普通大众的生活，深的人们喜爱。同时脑栓作为危害人类的十大疾病，给人们的生活带来极大困扰。因此，利用豆豉纤溶酶极好的溶栓效果，来开发对于的功能性食品，对人类的生活乃至生存都具有及其重要的意义。