低密度脂蛋白亚组分及分离检测方法的研究进展*

孙浩行，汪 骅，王长城 综述，李保国 审校

(1.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093；2.上海迪申生物技术有限公司研发部，上海 201201；3.上海交通大学医学院附属仁济医院检验科，上海 200025)

以低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高为特点的血脂异常是引起动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)的重要危险因素[1]。目前，国际专家组和科学指南均声明LDL-C为ASCVD的独立危险因素，并将减少ASCVD发病率及病死率的治疗方针专注于降低LDL-C上[2]。然而，部分研究发现，对ASCVD患者进行降脂治疗后，ASCVD发病风险却只减少了不到30%，部分患者LDL-C水平虽已降低至正常范围仍会发生ASCVD[1-2]。可见，单从LDL-C定量评估ASCVD发病风险和病情严重存在局限性。近来，低密度脂蛋白(LDL)亚组分颗粒大小的变化引起了人们关注。LDL为多分子复合物，在物理特性上具有异质性，可分为一系列密度、体积和动力学行为各不同的亚组分，密度为1.006～1.063 g/mL[3]。LDL异质性会导致各亚组分胆固醇水平不同，如LDL亚型颗粒直径减少3 nm，胆固醇减少约40%[4]。研究表明，LDL亚组分与ASCVD密切相关，同LDL-C相比，LDL亚组分能更好地评估ASCVD的发生和发展[2,5]。因此，ASCVD的临床血脂检测研究应注重LDL亚组分的检测分析。本文就LDL亚组分的分型及其与ASCVD的关系和最新分离检测方法等方面予以综述。

1 LDL亚组分

1.1LDL亚组分的分型 LDL亚组分主要是依据颗粒直径和密度进行分型。AUSTIN等[6]用梯度凝胶电泳根据颗粒直径不同将LDL分为两类：直径≥25.5 nm的大而轻LDL(lbLDL)和直径<25.5 nm的小而密LDL(sdLDL)。GEISS等[7]用密度梯度超速离心法(DGUC)根据密度不同将LDL分为7种亚型：LDL-1和LDL-2为lbLDL；LDL-3和LDL-4为中间密度LDL(ILDL)；LDL-5、LDL-6和LDL-7为sdLDL 。若进一步用DGUC分离sdLDL，可得到密度为1.044～1.060 g/mL的极小密度低密度脂蛋白(V-sdLDL)。同样，有研究者采用3%预制聚丙烯酰胺管状凝胶电泳(TGE)分离出7种LDL亚组分[8]。另外，有研究者用离子淌度法(IM)得到4种LDL亚型：LDL-Ⅰ、LDL-Ⅱ、LDL-Ⅲ和LDL-Ⅳ[9]；在此基础上，KRAUSS等[10]用IM法进一步得到7种LDL亚组分：LDL-Ⅰ为lbLDL；LDL-Ⅱa和LDL-Ⅱb为ILDL；LDL-Ⅲa和LDL-Ⅲb为sdLDL；LDL-Ⅳa和LDL-Ⅳb为V-sdLDL。LDL亚组分的分型方法有很多，虽然由于方法学原理不同而导致各研究结果有所差异，但总体的分型一致。迄今，国际上并未有标准的LDL亚组分分型标准，以上几种暂为目前研究领域常见分型。

1.2LDL亚组分与ASCVD 近年来，有研究表明，LDL亚组分不仅与ASCVD的发生和发展密切相关，并且比LDL-C能更好地评估ASCVD及相关疾病[10]。SHIFFMAN等[11]采用TGE法研究416例患者的LDL亚组分与心血管疾病(CVD)的关系，得出LDL-1和HDL均与CVD呈负相关，而LDL-3和LDL-6则与CVD呈正相关，并指出LDL亚组分颗粒间的变化是解释LDL-C不能准确评估CVD的可能因素。此后，SRISAWASDI等[12]又研究了260例患者的LDL亚组分与代谢综合征(MetS)的关系发现，LDL-C与MetS无显著相关性，而回归分析得到比值(LDL-3～LDL-6)/LDL-1与MetS有显著相关性(P<0.001)，表明(LDL-3～LDL-6)/LDL-1可作为评估MetS患者血脂代谢状态的优秀指标。

sdLDL作为LDL亚组分中密度大和体积较小的颗粒，由于其易于穿过动脉血管内壁，与LDL受体结合能力低，不易清除；在血浆中具有较长的半衰期、糖化易感性高、抗氧化性较低等特点，具有更强的致ASCVD潜在能力。诸多研究表明，sdLDL比LDL-C具有更重要的检测意义。MELANDER等[5]用IM法分析了1 919例使用他汀类药物未受益型CVD患者的LDL亚组分发现，随着患者sdLDL增加，CVD发病率提高了2.3倍。与此类似的是，SHIFFMAN等[11]从马尔默预防计划参与者中随机抽取1 784例CVD患者作为研究对象，在控制年龄、性别、高血压、抽烟和糖尿病等传统因素的影响后，发现LDL各亚组分都与CVD相关(P<0.001)；进一步控制LDL-C、HDL-C和TG因素后，sdLDL仍与CVD相关(P=0.03)。另外，MOGAREKAR等[13]在探究绝经后女性更易出现ASCVD原因时发现，绝经后女性体内sdLDL水平明显增高，sdLDL与年龄、三酰甘油、总胆固醇和LDL-C等呈正相关，与HDL-C呈负相关，指出定量检测sdLDL比单纯检测LDL-C更具临床价值。

2 LDL亚组分分离检测方法

2.1DGUC DGUC是根据LDL颗粒浮力密度的不同，经不同密度梯度盐溶液超速离心后LDL各亚组分依次转移至各密度区域。研究者可根据实际需求调整密度梯度，得到分型不同的亚组分。连续的DGUC可同时将脂蛋白各组分及亚组分分离，是分离LDL亚型的“黄金标准”方法，但所需血清样品较多，分离时间长，耗资高。并且由于脂蛋白a[Lp(a)]密度和sdLDL密度存在交叉区，分离LDL亚组分易受Lp(a)的影响。DONG等[14]选择1.044 g/mL作为lbLDL与sdLDL的分界点密度，在密度大于1.044 g/mL的分离溶液中加入巯基乙醇成功消除了Lp(a)的影响，得到两种LDL亚型：lbLDL(1.006～1.044 g/mL)和sdLDL(1.044～1.063 g/mL)。另外，由垂直转头发展的VAP-Ⅱ密度梯度超速离心法能同时分离和定量检测LDL亚组分。VAP-Ⅱ法是利用垂直转头密度梯度超速离心LDL后，经VAP-Ⅱ在线胆固醇检测仪检测后绘制出LDL亚组分的分布曲线，然后根据各曲线积分面积比例计算亚组分水平。同传统超速离心相比，VAP-Ⅱ法将离心时间缩短至1 h，并拥有高分辨率的特点。WILLIAMS等[15]采用VAP-Ⅱ法得到4种LDL亚组分，发现LDL亚组分中sdLDL与CVD相关性最强，并且独立于传统血脂指标。

2.2梯度凝胶电泳法(GGE) GGE是采用从大到小梯度孔隙的凝胶对LDL亚组分进行分离，并根据所占总染色面积的比例计算出各组分水平。AUSTIN等[6]用2%～16%的非变性聚丙烯酰胺梯度凝胶将LDL分为A型和B型，而WILLIAMS等[15]用2%～14%的非变性聚丙烯酰胺梯度凝胶得到7种LDL亚组分。此外，Berkeley HeartlabTM分段梯度凝胶电泳系统(LDL-S3GGETM)也可将LDL分离为7种亚组分。LDL-S3GGETM是分离LDL亚组分已标准化的梯度凝胶电泳体系，适用于临床诊断，但仅局限在Berkeley Heartlab实验室。GGE为一般实验室研究LDL亚组分常用方法，但分离时间在12 h之上。

2.3TGE Quantimetrix公司研发的LipoprintTM脂蛋白分析系统采用3%高分辨率线性TGE可将LDL分为7种亚组分。其原理是：血清与上样胶溶液(含亲脂染料苏丹黑B，可与脂蛋白中的胆固醇酯结合)混合加于浓缩胶上，经30 min光聚合后，每管3 mA，电泳60 min，避光静止30 min后在610 nm下进行光密度扫描。基于分子筛效应各亚型LDL分布在VLDL与HDL间，然后根据阻滞系数Rf值(RfVLDL=0，RfHDL=1)对LDL分型：Rf>0.40，sdLDL；Rf为0.38～0.40，ILDL；Rf<0.38，lbLDL。其中Rf值等于LDL亚组分与VLDL间距离/VLDL与HDL间距离的比值。LipoprintTM系统通过了美国FDA认证，可用于LDL临床诊断，具有良好的应用前景。BANULS等[16]将LipoprintTM系统的TGE法同GGE法对比分析LDL亚组分发现，两种方法在检测lbLDL(145例)和sdLDL(32例)时一致性分别达到97.2%和81.3%。还有学者在LipoprintTM系统的基础上做了优化，PATHAK等[17]根据质量设计方法发明一种分析LDL亚组分的高通量非变性TGE，采用3.15%分离胶可同时对40个样品进行分析检测，t检测结果同LipoprintTM系统差异无统计学意义(P=0.05)，同时将每个样品检测的成本降低到2美元。

2.4毛细管电泳法(CE) 毛细管等速电泳(CITP)可以将分离后的LDL组分压缩成窄小区带，具有高分辨率的特点。MORENO-GORDALIZA等[18]发明一种分离LDL亚组分的新型CITP法，在pH为8.8～9.4的梯度下9.5 min内完成分析，得到6个LDL亚组分峰。此外，由传统CE发展来的微芯片电泳技术实现了在刻蚀有微泳道的小型基片上分离检测LDL亚组分。WANG等[3]在此系统上向样品液中添加直径5 nm、80 nmol/L的纳米金提高了LDL亚组分间的分辨率。

2.5核磁共振法(NMR) NMR是根据LDL颗粒内核和外壳中脂类甲基团的质子磁共振信号检测颗粒大小，利用甲基团信号不同区分各亚组分，以NMR甲基团振幅测定亚组分浓度。MATYUS等[19]采用了NMR法对LDL进行检测分析，得到3种亚组分，批内、批间的精确度和重复试验变异系数CV为2.6%～5.8%，结果符合临床实验室的常规检测，可用于个人临床诊断。NMR虽能快速全自动检测LDL亚组分，但由于仪器特殊，难以在一般实验室展开。

2.6IM IM原理是使用电喷射产生气溶胶单电荷大粒子，然后经过不同的流动分析单元在大气压下根据离子淌度不同产生分离，随后冷凝聚集各粒子，最后进行激光散射扫描检测，将LDL颗粒直径和数量转化为各自的峰值和浓度。KRAUSS等[10]用IM分析了经两种血浆胆固醇酯转移蛋白抑制剂——默沙东和阿托伐他汀治疗后患者体内的LDL亚组分，结果显示虽然二者明显减少了患者LDL组分数量，但阿托伐他汀不会降低LDL-Ⅳb水平，且默沙东会使患者LDL-Ⅳ水平增加，推测V-sdLDL可能是患者经降脂治疗后仍出现ASCVD的关键因素。IM可直接对LDL亚组分颗粒大小和水平进行定量检测，是近年用于分离检测LDL亚组分的新方法，并且IM与DGUC、NMR和GGE等方法都具有良好的一致性[17]。

2.7其他检测方法 除了以上方法，较常见的LDL亚组分检测方法还有均相检测法、动态光散射法和高效液相色谱法等。动态光散射法用两种乳胶粒子溶液作为标准，以散射光的波动强度来检测LDL亚组分，需要较高的专业技术，设备也昂贵。高效液相色谱法检测LDL亚组分，需要对样品进行超速离心预处理，检测费时。DONG等[14]将HPLC和DGUC结合建立了一种新型同时检测HDL和LDL亚组分的方法，准确度和灵敏度达到了临床诊断的水平。近来有报道，用阴离子交换色谱法可将LDL分为5种亚组分：L1～L5，电负性依次升高，并推测与已氧化LDL颗粒类似的L5为主要的LDL，是致ASCVD的主要LDL亚组分[20]。

3 小 结

国内外对于ASCVD的防治指南都将降低LDL-C放在首位。然而在临床治疗中，LDL-C虽已降低，但ASCVD仍有发生。单纯检测LDL-C水平并不能全面评估ASCVD发病风险，应转移至LDL的微观结构上。大量研究都已证实，LDL亚型组分和ASCVD有直接的相关性，特别是sdLDL对ASCVD的危险评估优于其他常规血脂指标，这使LDL亚组分的分离检测尤为重要。虽然已报道的LDL分析方法有很多，但能用于临床自动化分析的很少。加快研究LDL亚组分分离检测新方法，使其尽快走向临床自动化分析尤为重要。而且，目前国际上并未有划分LDL亚组分的统一标准，各分离检测方法间也没用统一的评价规则，导致采用各方法学研究LDL亚组分的结论有所差异。这在一定程度上阻碍了LDL检测分析和LDL亚组分与ASCVD关系的研究。因此，未来需提高LDL亚组分的分离检测方法，并制订评价各方法的统一标准，尽快走向临床自动化分析。另外，探究LDL亚组分与ASCVD发生和发展的机制也将会推动LDL亚组分的分离检测和ASCVD的防控与治疗。