高通量技术在重症肺炎患者呼吸道病原体快速检测中的应用

张金李，冯 翔

(1.河南省开封市中心医院检验科 475000；2.河南省儿童医院检验科,郑州 450018)

近年来，病毒引起的新发传染病逐渐增多，对人类影响也越来越大，迅速准确的病原体诊断是治疗和防止暴发流行的最重要的步骤之一[1]。目前，病原体的诊断所用到的技术越来越多，基于不依赖序列扩增技术结合宏基因组的方法已成功用于检测和发现新病毒，即使在病毒数量很低的情况下，融合以上技术优势的高通量测序技术具备检测所有病毒的能力[2-3]。本文应用Ion torrent高通量测序平台对儿科1例重症肺炎患者进行病毒宏基因组分析，初步探讨其在临床病原体诊断中的应用，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 肺泡灌洗夜标本(BALF)来源于开封市中心医院儿科1例重症肺炎患儿，临床诊断为右肺肺炎，实验室诊断为肺炎支原体感染。给予红霉素、哌拉西林钠他唑巴坦、阿奇霉素抗感染治疗，效果不明显，临床医生怀疑其合并病毒感染。

1.2仪器与试剂 病毒DNA/RNA提取试剂盒购自MN公司；Ion torrent测序配套试剂购自Themo热科学公司；反转录试剂盒购自天根公司；长链高保真PrimeSTAR®GXL DNA Polymerase及Ex Taq PCR试剂购自于宝生物工程有限公司；腺病毒荧光定量试剂盒购自达安基因公司；所用聚合酶链反应(PCR)引物由上海英潍捷基公司合成；PCR产物纯化试剂盒购自Qiagen公司。

1.3方法

1.3.1肺泡灌洗夜标本病毒DNA/RNA提取 肺泡灌洗液标本处理：8 000 r/min，离心15 min，上清用于病毒基因组提取，DNA/RNA提取：取上清150 μL，试剂购于MN公司(NucleoSpin®RNA Virus 740956.10)，按照标准步骤进行。为了同时提取DNA病毒核酸，70 ℃水浴之前加入20 mg/mL蛋白酶K溶液20 μL。

1.3.2病毒DNA/RNA的随机引物扩增 取2 μL核酸，加入1 μL 100 pmol/μL接头引物FR26RV-N(5′-GCC GGA GCT CTG CAG ATA TCN NNN NN-3′)，75 ℃作用5 min后置冰浴2 min。按比例加入FastQuant RT试剂，42 ℃反应50 min，95 ℃ 反应2 min合成cDNA；加1 μL(2.5 U)DNA聚合酶Klenow片段，2 μL FR26RV-N(10 pmol)，2.5 μL 10×buffer，37 ℃反应60 min合成dsDNA，75 ℃灭活10 min。取上述反应液模板5 μL，加2 μL PrimeSTAR GXL DNA聚合酶，10 μL 5×PrimeSTAR®GXL缓冲液，4 μL dNTP混合物，4 μL 10 pmol/μL的扩增引物FR20RV(5′-GCC GGA GCT CTG CAG ATA TC-3′)，双蒸水补充至50 μL，经不依赖序列的单引物扩增：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。扩增产物纯化后采用Qubit2.0进行产物定量。

1.3.3高通量测序 文库构建、文库扩增以及测序按照试剂盒和仪器说明书进行。取100 ng纯化之后的产物，BioRuptor超声系统随机打断至200 bp，采用Ion XpressTMPlus DNA Fragment Library kit试剂盒连接接头；采用2% E-gel选择回收大小在330 bp的条带并采用Qubit2.0进行文库定量。油包水聚合酶链式反应(PCR)和磁珠颗粒(ISPS)富集采用Ion OneTouchTM200 Template Kit v2和Ion OneTouchTM进行油包水PCR；采用Ion Xpess template kit，MyOne streptavidin C1 beads和Ion OneTouchTMES进行模板富集。采用Ion PGMTMSequencing 200 kit及Ion 314TMChip进行测序，260个测序循环，标准压缩氩气进行驱动。

1.3.4腺病毒荧光定量PCR验证 使用达安腺病毒荧光定量检测试剂盒，进行腺病毒验证。

2 结 果

2.1高通量测序初步结果 芯片有效区域达到82%，其中连接有文库的有99%，除去36%多克隆、4%低质量和1%测试片段，最终有效的文库占59%，共591 593个读取片段，测序平均读长为159 bp，最长读长为333 bp，产生的测序原始数据总量为93.6 Mb，Q20为73.46 Mb。

2.2本地Blast及相关病毒分析结果 Fastq格式数据文件转换为fasta格式，选择一致性大于70%，E-value<10-5的序列作为有意义的序列，经本地Blast进行序列分类，一共获得591 593条读长，其中人类序列206 469条，占41%；细菌序列76 794条(15.0%)；真菌序列1 415条(0.3%)，其中病毒序列3 545条，占(0.6%)；病毒病原体主要有腺病毒序列1 760条(49.6%)，淋巴囊肿疾病病毒序列1 422条(40.1%)；Taterapox病毒65条(1.8%)，智利巨型病毒37条(1.0%)，云杉卷蛾雕背姬蜂病毒33条(0.9%)，猫白血病病毒32条(0.9%)，网状内皮组织增生证病毒30条(0.8%)，RD-114逆转录病毒18条(0.5%)，其他病毒共148条(4.2%)。

2.3腺病毒荧光定量PCR结果 呼吸道病原体荧光定量PCR结果为腺病毒7型，CT值为27.04。提示患者腺病毒7型感染。

3 讨 论

本研究通过采用不依赖序列的单引物扩增技术的病毒宏基因组方法结合Ion Torrent高通量测序平台对儿科重症肺炎患儿呼吸道肺泡灌洗液进行病毒病原体宏基因组分析，快速筛选出了标本中含有的腺病毒及其他病毒基因序列，整个试验只需2～3 d就能完成，测序成本也低至几千元，提示这种不依赖序列的病原体鉴定技术由于不需要预先知道病原体基因组信息，也不用专门针对病原体设计多对引物，特别适合于医院、疾病预防控制中心等机构在某种突发传染病的早期采用这种技术手段进行病毒性病原体鉴定，这种技术已成功用于病毒的鉴定、病毒基因组测序、输血制品病原体的筛选等[4]。

腺病毒7型是临床常见的病原体类型，主要引起上呼吸道急性感染，是社区获得性肺炎及重症肺炎的重要病原体[5]，患者肺泡灌洗液标本中也发现其他病毒种类序列的存在，淋巴囊肿病毒-中国株是引起上百种淡、海水鱼产生囊肿的主要病原体，暂无人感染病例的报道，其他如Taterapox病毒、智利巨型病毒、云杉卷蛾雕背姬蜂病毒等也暂时无人感染病例[6]。

本次测序数据中人类基因组序列所占比例较大，病毒序列只占很少一部分，与国内研究相似[7]，分析原因可能因为肺泡灌洗液中含有大量的宿主细胞，标本提取前未经使用过滤系统去除宿主细胞等体积较大的物质，也未加入DNA酶和RNA酶去除标本提取前存在的裸DNA和RNA有关。另外也可能与标本中腺病毒浓度有关，标本荧光定量PCR结果显示腺病毒CT值为27.04,腺病毒序列拼接基因组覆盖度79%，测序品均深度8×。有研究者发现，如果标本中病毒粒子的浓度大于107个/μL，则较容易获得相关病毒的全基因组序列及较高的测序深度[8-9]。相对于DNA病毒，高通量技术检测RNA病毒相对容易[10]。有试验证明，标本提取核酸之前依次进行高速离心、过滤和酶处理3步法处理能够富集病毒粒子，提高测序数据中病毒序列所占的比例[11]。

测序过程一个重要的挑战是数据分析，虽然有一些开放平台给研究者使用，如MetaVir和Vipie可免费使用，但是分析过程及等待时间均较长。因此，各个实验室及科研平台应该建立适合自己的平台，提高病原体检测速度。