帕金森病中的CDK5相关通路*

刘佩佩 综述，朱 艳 审校（扬州大学临床医学院/江苏省苏北人民医院神经内科，江苏扬州225001）

帕金森病（PD）是一种常见于中老年的神经退行性疾病。其发病时以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍为主要的临床表现。该病具有发病隐匿、进展缓慢、预后差等临床特点[1-2]。新的流行病学调查结果显示，中国年龄65岁人群PD患病率超过1%，美国60岁以上人群患病率则接近1%，且随着年龄的增加而升高。虽然多年来对PD进行了持续性研究，但PD的病因依然不明。目前，普遍认为，遗传因素、环境因素、神经系统老化等均有所影响[3-4]。其病理则表现为渐进性、选择性的黑质多巴胺能神经细胞的丢失及残存神经细胞出现特征性路易小体，且病理变化程度与PD患者症状相关[5]。

在许多神经退行性疾病中神经细胞的细胞周期重启被认为与神经细胞死亡密切相关。细胞周期依赖性激酶（CDK）则被认为在神经细胞的死亡中具有重要作用。其中CDK5不仅在神经细胞中表达较多，还在神经细胞的发育、生长过程中具有重要作用[6]，更是在异常细胞周期重启中发挥了重要作用[5，7-9]。

目前，PD的具体发病机制仍不明确。近年来，大量研究表明，细胞周期异常重启在PD发病过程中具有重要作用。而CDK5作为一个特殊的细胞周期蛋白依赖激酶，在很多通路中被观察到与PD的发生相关，如与肌细胞增强因子2D（MEF2D）、DNA修复酶嘌呤/嘧啶内切酶1（Ape1）等相联系的信号通路等。现对CDK5在PD的发生中的相关通路进行简要回顾。

1 CDK5⁃parkin 途径

有关PD的遗传研究结果显示，至少有9个基因突变被认为与家族性PD相关，其中parkin基因（PARK2）突变较为常见[10]。PARK2突变与常染色体隐性遗传的青少年型PD发病相关。此外，还有研究表明，PARK2也是散发型PD的危险因素之一[11]。

PARK2包含了12个外显子，在许多组织中广泛存在，尤其是在肌肉及大脑中[12]。其编码具有泛素连接酶活性的parkin蛋白。而泛素作为一种被广泛需求的转录后调节因子在许多细胞通路中起作用，如细胞周期的调控、内吞、DNA修复等。泛素与目的蛋白结合需要泛素活化酶、泛素结合酶及泛素连接酶共同发挥作用。PARK2突变影响了parkin蛋白功能，进而影响其与下游的连接[11，13-14]。

parkin蛋白可受多种内外因素及转录后调节，CDK5可磷酸化parkin蛋白。AVRAHAM等[15]研究表明，无论是体内环境还是体外环境，CDK5均可磷酸化parkin蛋白。CDK5主要在S131位点磷酸化parkin蛋白，以调节其泛素连接酶的作用，影响其与底物synphilin-1或丝裂原活化蛋白激酶p38的结合。而synphilin-1则与PD患者包涵体的形成、聚集相关。当parkin蛋白的S131突变时失去了CDK5的磷酸化，S131A的parkin蛋白的泛素连接酶的功能得到加强，更加有利于内涵体的聚集。提示CDK5是parkin蛋白的一个新的调节因子，CDK5对其的磷酸化会增加毒性parkin蛋白底物的聚集，降低多巴胺能神经细胞对毒素的抵制[5，15]。

CDK5在S131位点磷酸化parkin蛋白增强了parkin蛋白作为底物与酪蛋白酶Ⅰ的结合能力。RUBIO DE LA TORRE等[5]对parkin蛋白进一步的研究发现，酪蛋白酶Ⅰ可在S101、S127、S378位点磷酸化parkin蛋白。当这3个位点全部突变时酪蛋白酶Ⅰ则几乎完全不能与parkin蛋白结合。而当CDK5主要磷酸化的S131位点突变时酪蛋白酶Ⅰ与parkin蛋白的结合程度较野生型降低。同样情况发生在应用了CDK5的高选择性抑制剂—— 罗考维停（roscovitine）之后，证明CDK5在S131位点对parkin蛋白磷酸化可使parkin蛋白能更好地与酪蛋白酶Ⅰ结合。

2 钙依赖蛋白酶（calpain）-丝裂原活化蛋白激酶p35⁃p25/CDK5⁃MEF2 途径

SMITH 等[16]对 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的PD模型中的CDK5及其上、下游均进行研究发现，MPTP造模后，p25水平上升，但p35水平变化不大，说明p35因钙蛋白酶作用而转变为p25在整体中所占的比例不大。使用选择性钙蛋白酶抑制剂后，p25水平明显下降。同时，MPTP作用后CDK5活性明显上升，而该活性上升程度亦可被钙蛋白酶抑制剂在一定程度上抑制。但CDK5被钙蛋白酶抑制剂影响的程度小于p25被影响的程度，说明CDK5活性可能具有更多的影响因素。但钙蛋白酶在CDK5的活化中仍具有重要作用。

进一步的研究结果显示，在生理情况下p35缺如小鼠与野生型比较，黑质神经细胞数量、运动功能、酪氨酸羟化酶（TH）均无明显差异。TH是多巴胺合成限速酶，亦是多巴胺能神经细胞的表型标志物之一，其可被CDK5磷酸化，反过来可使CDK5活性上升。MPTP处理后TH在野生型中的数量却较p35缺如型明显下降，而在钙蛋白酶抑制剂处理的样本中也观察到同样现象。同时，黑质中的神经细胞也与TH保持同样的变化趋势。在MPTP模型中p35缺如或钙蛋白酶抑制剂作用，阻断了CDK5对下游的影响，从而对神经细胞起到了保护性作用。

MEF2是一种促存活转录因子，有A～D 4种亚型，是一个在许多细胞周期过程中具有重要作用的因子，其中包括神经细胞的存活过程。MEF2是多个关键性细胞内信号通路的终点，这些通路均影响着细胞的存活和凋亡[17]。SMITH 等[16]和 MOUNT 等[18]研究证实，MEF2在MPTP模型中对多巴胺能神经细胞具有保护作用。

GONG等[19]研究表明，无论是体内实验还是体外实验，CDK5均可磷酸化MEF2以抑制其转录活性。而神经毒素可增强CDK5活性。进一步研究发现，MEF2转录活性主要由其被磷酸化的程度所决定，而并不太受MEF2蛋白量的影响[20]。外源性 dnCDK5（dominant-negative form of CDK5）能加强结合能力，但没有酶活性，且可通过抢夺p35或p25而影响内源性CDK5的能力。当外源性dnCDK5作用时，与无外源性dnCDK5时比较，被抑制的MEF2活性明显回升。当应用CDK5高选择性抑制剂——Roscovitine时结果相同，说明上升的CDK5活性确实抑制了MEF2相关基因转录能力。

也有研究发现，CDK5可在S444位点磷酸化MEF2。当S444位点突变时被磷酸化的MEF2明显较野生型减少。突变的MEF2可抵制CDK5的磷酸化，且可保护神经细胞免于神经毒素引起的细胞凋亡。

3 CDK5⁃Ape1 途径

Ape1是氧化或其他因素导致基因损伤后对DNA进行修复的碱基切除修复通路中一个重要的酶。在碱基切除修复通路中Ape1发挥其脱嘌呤/脱嘧啶（AP）内切酶活性，切开AP位点。AP位点可进一步被其他的酶作用以修复DNA。这是氧化性DNA损伤时一条主要的修复途径[21]。另外，Ape1还具有类似氧化还原因子的作用，可保持转录因子处于还原态，这是转录因子可进行转录的首要条件。

HUANG等[22]对CDK5及Ape1之间的联系进行研究发现，MPTP作用后可诱导CDK5对Ape1的磷酸化。免疫共沉淀也证实，Ape1直接与p35相连接。且当Ape1的t232位点突变时被CDK5/p35的磷酸化水平明显下降；当S53位点突变时磷酸化水平轻微下降；当ST2位点突变时对磷酸化无影响。而使用CDK5高选择性抑制剂——roscovitine可消除所有的磷酸化。说明CDK5/p35直接作用于Ape1，且主要在Thr232位点磷酸化Ape1。进一步采用p35-/-的模型进行相关研究，依然未发现磷酸化的Ape1。说明在MPTP模型中Ape1的磷酸化只由CDK5所引导。

进一步研究CDK5介导的Ape1磷酸化对其功能的影响时发现，Thr232位于Ape1的C′端，已被证实与Ape1的 AP内切酶活性相关[23]。分别突变 T232、S53、ST2位点，并分别在CDK5/p25阴性、CDK5/p25阴性的情况下，比较其相应的AP内切酶活性，结果显示，CDK5虽对多个位点具有磷酸化作用，但只在Thr232位点的磷酸化会降低Ape1内切酶活性。抑制CDK5活性时可明显提升AP内切酶活性。

有研究对Ape1进行了小干扰RNA转染，并对相应的神经细胞进行荧光标记。在MPTP模型中发现，未转染Ape1时存活的神经细胞较多。而转染后Ape1功能受影响，死亡了较多的神经细胞。证实在MPTP模型中Ape1对神经细胞具有保护作用。而CDK5对Ape1的磷酸化，降低了其AP内切酶活性，影响了Ape1的功能，降低了其对神经细胞的保护作用，从而加重了MPTP模型中神经细胞死亡及DNA损伤。

此外，BUSSO等[24]报道，CDK5可增强内源性Ape1泛素化，而Ape1泛素化可能与其修复DNA功能及基因调节能力具有内在联系，但目前其具体机制尚不明确。

4 CDK5⁃过氧化物还原酶 2（Prx2）途径

Prx2是一种具有过氧化物酶活性的抗氧化剂，而氧化应激也是PD的可能致病因素之一[25]。有研究对Prx2及PD之间关系进行了探讨。

QU等[26]研究发现，在MPTP作用的细胞或小鼠模型中Prx2直接通过p35与CDK5结合。当p35-/-时Prx2磷酸化水平有所下降，但不是完全的改变，可能由于丝裂原活化蛋白激酶p39存在的缘故。因而改用CDK5高选择性抑制剂——roscovitine，Prx2磷酸化水平同样下降了，证实Prx2的磷酸化确实受CDK5的影响。进而推测CDK5可能是在T89位点磷酸化Prx2。该研究分别检测了野生型Prx2及T89位点突变的Prx2在MPTP作用下的磷酸化水平，结果显示，Prx2在T89A位点上几乎未检测到磷酸化，从而说明CDK5对Prx2的磷酸化发生在T89位点。

那么，CDK5对Prx2的磷酸化对其功能有何影响呢？有研究将磷酸化Prx2与未磷酸化Prx2分离，采取相同的数量以评估磷酸化前后Prx2过氧化物酶活性，结果显示，磷酸化Prx2过氧化物酶活性仅为未磷酸化Prx2的37%，即磷酸化Prx2过氧化物酶活性明显降低。所以，CDK5在T89位点磷酸化Prx2，降低了Prx2过氧化物酶活性。

Prx2活性降低的影响可通过Prx2在MPTP模型中作用来说明：（1）经MPTP处理后Prx2含量并未明显增高，但磷酸化Prx2含量却发生了显著变化。（2）Prx2的活性受T89位点磷酸化影响，Prx2的存在可显著保护神经细胞免于死亡。而Prx2 T89A影响了CDK5对Prx2的磷酸化，同样表现出毒性情况下对神经细胞的显著保护作用。而应用干扰小RNA干扰了Prx2的表达时神经细胞也相应地对MPTP毒性更加敏感，存活更少[27]。表明Prx2对神经细胞具有保护作用。MPTP作用的模型中CDK5在T89位点磷酸化Prx2，降低了Prx2过氧化物酶活性，降低了Prx2的保护作用，则可加重神经细胞死亡[26，28]。

上述途径并不只存在于PD或相关模型中，在其他疾病中也存在并发挥着相应作用，如CDK5与Prx2在缺血损伤模型中也具有重要关联[29]。但其在具体不同疾病中所起的作用及作用大小仍需进行相关的研究加以证实。此外，CDK5与PD之间尚存在其他的可能途径，如CDK5与α-核突触蛋白（α-synuclein）之间存在关联，CDK5 可促进 α-synuclein 聚集[8-9，30]，但具体的路径尚不清楚，尚有待于进一步研究。

综上所述，CDK5在PD的神经细胞死亡中发挥了重要作用，其有可能是PD治疗的一个靶点。但由于CDK5具有复杂的生物学效应，在成为治疗靶点前尚有大量疑问需进一步研究澄清。

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