表观遗传调控在巨噬细胞极化中的研究进展*

王捷敏 综述，王胜军 审校

(江苏大学检验医学研究所，江苏镇江 212013)

巨噬细胞作为一种异质性固有免疫细胞，具有极其重要的理论研究和临床应用前景。近年来，表观遗传调控巨噬细胞极化成为学者们改造巨噬细胞来治疗感染与炎症的研究方向。表观遗传是指DNA序列不存在改变，而基因表达发生可遗传的改变，如DNA甲基化，组蛋白修饰，非编码RNA调控等表观修饰方式单独或联合作用以影响基因表达与维持。表观遗传参与到许多生物进程的调控，包括肿瘤发生、发展，免疫细胞分化发育等。和T细胞分化发育一样，巨噬细胞在一些关键转录因子及信号途径的作用下，由前体细胞分化并活化为不同极化状态的亚型。该过程伴随着大量炎症及表型相关基因的表达或抑制[1]，同时，基因组的表观遗传修饰状态也存在动态改变。目前发现，多种表观修饰酶影响巨噬细胞极化状态，但对于其为何能作用于巨噬细胞以及详细机制仍然有待深入研究。本文针对巨噬细胞极化过程中表观修饰状态变化及其调控作用予以综述。

1 巨噬细胞的极化及其功能

科学家们根据巨噬细胞对不同细胞因子及微生物激活后的表型及功能状态对巨噬细胞进行了分类[2]：由经典方式活化的巨噬细胞(CAM)，又称M1型巨噬细胞，在诱导活化后产生大量促炎性物质如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-12和IL-1，主要参与对抗细菌、病毒感染；选择性活化的巨噬细胞(AAMs)，也称M2型巨噬细胞，主要在一些非炎性因素刺激下产生，参与抗寄生虫感染、血管形成、组织重塑甚至肿瘤发展。根据刺激剂不同，M2型巨噬细胞可进一步分为M2a、M2b和M2c 3个亚型。其中，由IL-4和IL-13诱导的巨噬细胞活化为M2a，而M2b是在免疫复合物与TLR或IL-1R配体同时作用下诱导形成，IL-10或糖皮质激素诱导巨噬细胞为M2c亚型。近年来，肿瘤微环境重要构成部分-M2亚型也越来越引起研究者的注意。总之，巨噬细胞通过整合来自微生物、损伤组织或正常组织的不同信号分子，活化为不同功能亚型以适应或对抗外界环境，即极化是特定时间和环境中活化状态的总体估算。然而巨噬细胞极化是一个连续性的过程，典型的M1和M2型极化只是简化的两种极端功能状态，而且越来越多的研究发现该过程受到由转录因子和表观遗传修饰交织形成的复杂网络调控。

2 表观遗传学

2.1DNA甲基化 作为最常见的表观遗传修饰方式，DNA甲基化在基因表达沉默过程扮演重要角色。比如，经一系列DNA甲基转移酶(DNMT)介导，CpG双核苷酸中的胞嘧啶甲基化影响转录因子在此处的募集从而阻断某些基因的表达，改变细胞生命活动。

2.2组蛋白修饰 与DNA甲基化常造成基因沉默不同，组蛋白甲基化位点及程度不同与染色质紧密或疏松状态都相关。一般来说，组蛋白H3的N端第4位(H3K4)，第36位(H3K36)二甲基化或三甲基化与转录激活有关。相反，H3K9的二甲基化或三甲基化，H3K27、H3K79的三甲基化则是基因转录抑制标志。这些组蛋白甲基化水平是由组蛋白甲基转移酶(HMTs)以及去甲基化酶(HDMs)共同调节的。构成核小体的组蛋白通过甲基化、乙酰化及磷酸化等，特异性组合在一起构成“组蛋白密码”，通过改变染色质紧密结合或疏松状态变换转录因子的可接近性，导致转录抑制或活化，影响基因表达，改变细胞的表型及功能状态。因此，根据基因转录的促进或抑制作用将不同染色体组蛋白修饰粗略分为活化型与抑制型标记[3]。

2.3非编码RNA调控 随着基因组及转录组深度分析，曾被认为进化过程中累积的“垃圾序列”越来越多被发现是参与基因调控的非编码RNA(分为短非编码RNA和长非编码RNA两类)。虽然非编码RNA对于巨噬细胞极化的调控机制大部分未知，到目前为止人们已发现不少非编码RNA，尤其是miRNA参与巨噬细胞极化调控[4]。GRAFF等[5]发现，巨噬细胞在受到外界刺激(如LPS、IL-4)时，miRNAs表达量会发生明显改变。相应的，过表达或抑制部分miRNA后，也会调控巨噬细胞极化进程。目前已确认的促进M1型巨噬细胞极化的miRNA有miR-155、let-7c、miR-125a-5p，相应的促进M2型的miRNAs有miR-223、miR-124、miR-146等，本文不作分析。

3 巨噬细胞极化过程中的表观遗传现象

前体细胞分化为成熟巨噬细胞过程中需要许多转录因子协同作用，其中转录因子PU.1和C/EBPα的作用尤为重要。KAPELLOS等[6]研究发现，PU.1结合到巨噬细胞基因组DNA利于染色质稳定打开，不仅能募集与巨噬细胞功能与表型相关的其他转录因子，还被发现存在于基因组反式作用元件启动子与增强子区域，这可能与启动子与增强子表观遗传修饰有关。巨噬细胞分化过程中整体基因组即已形成了转录因子与表观遗传双重调节网络，其基因启动子与增强子上具有一定水平的组蛋白标记(分别为H3K4me1和H3K4me3)，转录起始点(TSS)上游区域核小体被去除，从而具有基础水平的转录[7]。转录效率则由被募集的引导转录因子JunB、IRF4等决定。巨噬细胞接受刺激后引导转录因子招募其他转录因子如炎性相关转录因子核转录因子-κB(NF-κB)作出应答。成熟巨噬细胞极化表型相关的基因在巨噬细胞分化后存在不同“组蛋白密码”[8]：(1)含抑制型标记H3K9me3和H3K27me3，缺乏活化型标记，具有相对封闭的染色体构象，这类基因能抵抗急性刺激的诱导。(2)处于“准备”状态，具有活化型组蛋白标记如H3K4me3、H3K9ac，染色体构象部分打开，而且某些基因TSS会预先结合RNA聚合酶Ⅱ。这类基因的转录可能受限于同时存在的抑制性组蛋白标记(如H3K9me3和H3K27me3)及共抑制复合物，需要活化额外组蛋白标记和依赖ATP的核小体重塑才能打开不完全闭合的染色体，为转录因子提供全面亲和性。(3)某些基因具有活化型组蛋白标记的活化状态，具有开放性染色体构象，并且能持续转录。

3.1干扰素(IFN)启动M1活化 IFNs预处理可促使病原相关分子模式(PAMPs)或炎性细胞因子刺激后的巨噬细胞分泌更高水平的促炎因子，达到M1全面活化。有报道称共生微生物诱导巨噬细胞产生基础水平IFNs信号，维持其在“准备”状态，在受到感染信号刺激后迅速作出强烈反应[9]。现已明确IFN预处理后，IFNb、IL-6和TNF启动子活化型标志H3K4me3上调，同时该区域附近NF-κB亚单位p65和polⅡ也增多。有意思的是，甲型流感病毒蛋白NS1能模拟含H3K4的多肽，阻碍IFNs反应基因启动子活化性标志H3K4me3的阅读而使其沉默[10]。因此，表观修饰参与IFN启动的巨噬细胞促炎因子表达，进而可能调控固有免疫反应。

3.2Toll样受体(TLRs)触发M1极化 TLRs信号能活化巨噬细胞内NF-κB、干扰素调节因子(IRFs)、信号转导与转录激活因子(STAT1)途径，引起下游炎症相关细胞因子及趋化因子表达，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12p40、CXC10，形成M1型巨噬细胞。尽管这些基因活化机制不完全相同，但是存在着类似的表观修饰方式。炎症相关细胞因子未接受TLR信号刺激时，受抑制型组蛋白标志H3K9me3、H3K27me3或H4K20me3限制，转录受限而处于“准备”状态。BCL6及核受体募集共抑制复合物(含限制活化型组蛋白标记强度的HDACs、HDMs)也可特异性对某些炎性细胞因子造成转录抑制[11]。除组蛋白修饰，IL-12b、IL-6等基因染色体可接近性还存在受限。TLR触发活化后，巨噬细胞这些表观“抑制闸”松开，BCL6和共抑制复合物从基因座区域解除，组蛋白去甲基酶JMJD3、AOF1和PHF2等同时被诱导表达，去除抑制型组蛋白标记H3K9me3、H3K27me3和H4K20me3。IL-6和IL-12b等基因还需依赖ATP染色质重构复合物BAF(也称SWI或SNF)介导核小体重塑后方可诱导表达[12]。这些表观重塑增加了活化型组蛋白标志H4-Ac和H3K4me3与增强子乙酰化程度，有利于炎性转录因子(如NF-κB)募集，促使转录延伸。因此，TLRs信号诱导巨噬细胞M1极化的过程中，下游炎性及表型分子转录受到多种表观修饰的动态调控，然而目前TLRs将信号传送给染色体和组蛋白的详尽机制仍不清楚。

TLRs诱导M1后，炎性因子的表达在刺激持续一段时间后会恢复至基础水平，甚至表达抗炎因子及M2标志性产物，即转变为耐受状态。TLR诱导的ATF3、Hes1，IL-10诱导的反馈抑制因子以及NF-κB亚单元p50募集含HDACs及HDMs的共抑制复合物，可能与这些炎性基因表达下调有关[13-14]。有意思的是，耐受可被M1极化因子IFN-γ或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)延迟，这与转录抑制因子如Hes1的表达抑制部分相关[15]。此外有证据显示，核小体重塑及组蛋白去乙酰化酶复合物(NURD)可使核小体构象变化，阻碍转录因子及转录机器与基因座亲和，造成基因表达抑制[16]。不过与活化相比，科学家们对基因表达的抑制了解相对较少。要明确参与该耐受过程的染色体重塑复合物详细作用机制还需进一步通过全基因组染色体状态分析。

3.3巨噬细胞选择性极化 巨噬细胞在几丁质或寄生虫感染后，可依赖组蛋白去甲基酶JMJD3选择性极化。由于H3K27me3与基因表达抑制相关，科学家起初猜测JMJD3参与M1极化基因的表达，然而JMJD3缺陷小鼠无论是TLRs信号刺激还是李斯特菌感染后，炎性细胞因子表达都不受影响[17]。相反，M-CSF诱导JMJD3敲除小鼠BMMC时M2极化标志分子Arg1、Ym1、Fizz、MR和IL-13的表达显著缺陷，表明JMJD3对于M-CSF诱导巨噬细胞M2基因表达是必需的。全基因组染色体免疫沉淀及高通量测序分析(ChIP-seq)表明M2基因并非由JMJD3直接作用产生。研究发现，巨噬细胞几丁质或M-CSF诱导的选择性极化中，JMJD3通过去除促M2关键转录因子IRF4基因座上抑制型组蛋白标记H3K27me3促进M2选择性极化[18]。除此之外，IL-4诱导下JMJD3依赖于STAT6表达上调，进而降低M2标志分子H3K27甲基化程度，引起转录激活[19]。然而，JMJD3缺陷的BMMC在IL-4诱导下仍具有选择性极化能力，这表明巨噬细胞还存在不依赖JMJD3的其他方式向M2极化。当然，这些试验结果不完全相同也可能是试验培养条件及方法灵敏度不同造成。因此，JMJD3主要参与M2选择性极化，而在M1极化中作用较弱。另外，与JMJD3参与促使巨噬细胞选择性极化不同，HDAC3能够降低IL-4诱导M2相关基因增强子的乙酰化程度，从而可作为IL-4诱导M2极化的“闸”[18]。因此，无论是组蛋白甲基化还是乙酰化对M2极化都起到举足轻重的作用。

4 表观遗传修饰指导巨噬细胞极化

机体遇到损伤或感染时，诱导巨噬细胞向M1型极化抵抗外界刺激，然而持续的炎症也会造成组织损伤，之后巨噬细胞转变为抑制炎症的M2型，启动组织重塑。例如，急性心肌梗死发生后，大量促炎型M1迅速募集到梗死区域，吞噬并清除凋亡坏死的细胞。在梗死后期，促心肌成纤维细胞形成的M2数量增多并占主导地位，进行心肌重构[20]。然而，一些慢性炎症状态下M1/M2比例失衡，如2型糖尿病脂肪组织中促炎型M1上调而M2极化受限，最终造成慢性炎症和胰岛素抵抗[21]。同样的，肿瘤微环境中的巨噬细胞即肿瘤相关巨噬细胞(TAM)也异常极化，呈现促肿瘤血管生成的免疫抑制表型，不同方式逆转TAM向M1表型转化后可使免疫抑制微环境好转。目前，已知各种表观修饰的酶能作用于巨噬细胞炎性基因关键部位组蛋白，改变其甲基化或乙酰化程度，共同调控M1/M2极化平衡。那么，可否通过改造巨噬细胞表观遗传状态，指导其极化从而为肿瘤、肥胖、类风湿关节炎等疾病提供治疗策略呢？答案是肯定的。通过分析启动子、增强子状态发现，局部区域微环境能重塑组织特异性巨噬细胞基因活性。例如，Gata6增强子仅在腹腔巨噬细胞中呈现活化。同样体外TGF-β处理可使已分化的巨噬细胞基因表达重新编排[22]。上述现象说明，与巨噬细胞来源相比，微环境刺激信号更能指导巨噬细胞命运。研究表明，HDACs可诱导巨噬细胞促炎基因表达，使用一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂(iHDACs)MS-275处理后，不仅能有效减轻局部免疫细胞及促炎因子的积聚，还可促使巨噬细胞由M1向M2极化[23]。类似的，另一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid通过上调GSK3b的表达间接增强PI3K/Akt信号通路，促进小胶质细胞向M2方向极化[24]。同样的，其他iHDACs，如ITF2357可使IL-6及IL-6R下调，丙戊酸通过抑制促炎因子及CD40、CD80表达减少M1极化[25]。iHDACs能够调控巨噬细胞基因转录，减少促炎性M1细胞因子与趋化因子的产生，增加M2基因表达，为减轻小鼠气道炎症等提供治疗依据[26]。另外，DNMT也参与巨噬细胞极化进程。肥胖小鼠DNMT3b异常表达，引起过氧化物酶体增殖物激活受体γ1(PPARγ1，一种核受体，参与M2极化的关键转录因子，其启动子区CpG含量丰富，易于被表观调控)启动子区DNA甲基化程度升高，使其表达被抑制，导致巨噬细胞向M2极化受限，从而导致脂肪组织慢性炎症，而DNMT3b敲除后呈现相反趋势[27]。还有研究表明，DNMT1引起细胞因子信号转导抑制蛋白1(SOCS1)启动子甲基化水平升高，使其表达被抑制。使用DNMT抑制剂5-azadC将DNMT1沉默后，SOCS1基因启动子区甲基化程度降低，阻断了LPS诱导的巨噬细胞JAK2/STAT3通路活化，减轻促炎表型[28]。因此，使用靶向DNMT的iDNMT可用于控制促炎M1表型，促进抗炎的M2反应。总之，通过单独或联合应用iHDACs、iDNMT都能达到减轻M1，促进M2的效果，这为将来发现并应用新的表观遗传修饰药物奠定了基础。

5 小结与展望

表观修饰的酶能作为中介，与转录因子共同介导环境因素与巨噬细胞表型的复杂调控网络，参与巨噬细胞活化的方方面面。相比其他磷酸化信号转导蛋白，表观遗传标记具有长期性，这已成为针对巨噬细胞治疗慢性炎症的重要支点。目前对于极化过程的认识比较局限，而且没有严格的衡量标准来界定巨噬细胞极化状态。通常用于反映分型及功能的标志分子也并不能完全代表某个亚型巨噬细胞。但是，未来表观遗传调控巨噬细胞极化研究领域中，全基因组测序技术的应用及巨噬细胞分离纯度的保证将起到巨大推动作用。另外，还有一些表观修饰方式与巨噬细胞极化的联系尚未被揭示，许多表观修饰后的基因与巨噬细胞极化的关系仍不明确，仍需进一步探索。

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