miRNA-198表达异常与难治性糖尿病溃疡的相关性研究

王 娟，侯俊秀，张川江

(1.内蒙古医科大学附属医院内分泌科，呼和浩特 010050；2.内蒙古精神卫生中心心身科，呼和浩特 010010)

MicroRNA(miRNA)是一种非编码RNA，可以靶向结合信使RNA(mRNA)并发挥降解或抑制其翻译的作用，然后实现转录后基因表达的相关调控效果。近年来人们发现，miRNA 作为基因表达调控分子中的重要一员，在皮肤发育、多种皮肤病以及皮肤溃疡和创伤愈合过程也同样具有重要的调节作用[1-3]。近年来国内外相关研究也开始更多地关注其与皮肤创伤愈合的相关性及其在溃疡等愈合中所起到的作用[4-5]。国外有研究提示，健康皮肤受损时miR-198 生成停止，可见miR-198 水平降低，提示机体开启伤口愈合通道。糖尿病性溃疡是一种病程迁延且病情复杂、处理困难的并发症，且预后相对较差，往往久治不愈，严重影响患者的生活质量，这种未愈合的伤口中长期存在miR-198，会抑制伤口愈合[6-7]。本文就外周血miRNA-198表达异常与难治性糖尿病溃疡的相关性进行了初步探索，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年7月至2017年7月在内蒙古医科大学附属医院就诊的48例2型糖尿病并发慢性难治性溃疡的患者作为溃疡组，其中男29例、女19例，平均年龄(58.29±7.03)岁，平均糖化血红蛋白(HbA1c)水平为(9.93±2.45)%，平均糖尿病病程(15.98±3.27)年；同时选取年龄、性别具有可比性的新诊断的65例2型糖尿病无任何急、慢性并发症患者作为单纯糖尿病组，其中男40例、女25例，平均年龄(57.23±9.88)岁，平均HbA1c水平为(9.94±3.82)%，平均糖尿病病程(15.55±4.02)年；另选择同期65例健康人作为健康组，其中男39例、女26例，平均年龄(58.04±6.39)岁，平均HbA1c水平为(5.01±0.88)%。溃疡组和单纯糖尿病组患者HbA1c水平均高于健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。3组研究对象性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有糖尿病患者均符合1999年WHO关于 2型糖尿病诊断标准，排除合并其他严重并发症和其他严重疾病及自身免疫性疾病者。所有受试者对本研究知情同意，并签署知情同意书。

1.2仪器与试剂 miRNA-198的测定采用实时定量聚合酶链反应(PCR)技术，主要试剂及仪器为miRNeasy血清/血浆RNA提取试剂盒、miRNeasy血清/血浆外参，均购自德国Qiagen公司；荧光定量PCR引物、TaqMan通用混合荧光定量PCR试剂盒Ⅱ、TaqMan MicroRNA反转录试剂盒、ABI9700型PCR仪、ABI 7900HT Fast Read-TimePCR System，均购自美国ABI公司。

1.3方法 对全部受试对象进行面访，通过问卷调查收集患者超重/肥胖、高血压现病史、高血压家族史及糖尿病家族史等相关信息。然后将Ficoll-Paque PLUS液室温放置，应用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集患者早晨空腹静脉血5 mL，取2 mL EDTA抗凝血与等体积平衡液在15 mL离心管中用移液管充分混匀，用针管抽取3 mL Ficoll Paque PLUS液至新的离心管中，轻轻用移液管沿管壁缓慢滴加准备好的样品于分层液面上离心。将血浆置于冻存管中，于-80 ℃环境下保存备用。采用血液总RNA快速提取试剂盒(miRNeasy血浆提取试剂盒)提取总RNA。按照miRNA反转录试剂盒说明书进行反转录反应。实时荧光定量PCR按照TaqMan通用混合试剂盒Ⅱ说明书进行。PCR Ct值通过ABI 9700实时荧光定量PCR仪进行测定，每个反应重复2次。测定并比较患者血清中miRNA-198表达水平，对miRNA-198表达水平与难治性溃疡之间潜在相关性进行分析。

2 结 果

2.1各组受试者超重/肥胖、糖尿病家族史、高血压现病史、高血压家族史情况 溃疡组和单纯糖尿病组患者中超重/肥胖、糖尿病家族史、高血压现病史、高血压家族史比例均高于健康组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 受试者超重/肥胖、高血压现病史、糖尿病家族史、 高血压家族史情况情况比较[n(%)]

注：与健康组相比，*P<0.05

2.23组受试者外周血中miRNA-198的表达情况比较 溃疡组患者外周血miRNA-198表达水平为(2.67±0.42)Ct，单纯糖尿病组为(2.43±0.42)Ct，健康组为(2.43±0.21)Ct，3组miRNA-198表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。进一步作两两比较发现，溃疡组水平分别高于单纯糖尿病组和健康组水平，差异有统计学意义(P<0.05)；单纯糖尿病组与健康组间差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 miRNA-198表达水平及其他相关潜在影响因素与糖尿病难治性溃疡之间的相关性

2.3miRNA-198表达水平及相关潜在影响因素与糖尿病难治性溃疡之间的相关性 研究发现，miRNA-198表达水平增高可以增加1.679倍糖尿病难治性溃疡的风险(OR值为1.679，P<0.01)；此外，超重/肥胖、高血压现病史以及高血压和糖尿病家族史都可以增加患糖尿病难治性溃疡的风险(OR值分别为1.242、1.317、1.094、1.176,P<0.01)。见表2。

3 讨 论

糖尿病本身是由遗传因素、免疫功能因素以及环境因素等众多致病因子作用下，机体出现胰岛功能减退以及胰岛素抵抗等而引发的糖代谢紊乱，同时还常常伴有蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢的稳态失衡，是一种临床上常见的慢性疾病，以高血糖为主要特点[8-9]。糖尿病慢性并发症发生率越来越高，全球每年约有320 万人死于糖尿病的各种并发症，慢性并发症已经成为糖尿病患者致残致死的主导因素。其中糖尿病性溃疡是一种病程迁延且病情复杂、处理困难的并发症，且预后相对较差，往往久治不愈，严重者还有可能导致截肢致残。糖尿病溃疡严重影响患者的生活质量，而且由于治疗尚缺乏高效手段，治疗周期长，加之医疗费用相对也较高，给患者家庭及社会都带来沉重的负担[8-10]。因此，对于糖尿病性溃疡，特别是难治性糖尿病性溃疡，深入探究其机制，寻求更高效的防治手段，意义重大。

我国糖尿病并发足部溃疡引发的截肢患者近年也有所增加。糖尿病诸多慢性并发症中包含大血管病变，比如心脏病、高血压、脑血管意外以及下肢血管病变等；还有微血管病变，比如糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病及神经病变等等[10-12]。其中糖尿病引发的溃疡以及下肢动脉和静脉疾病引起的难愈合型的溃疡及创面已经成为糖尿病患者所面临的主要危害之一。高血糖环境会引发创面无法有序、及时地修复，伤口逐渐形成溃疡，因此糖尿病并发慢性溃疡的发生率很高，而且溃疡创面往往反复发作成迁延状态[13-14]。

目前认为神经病变、缺血和创伤是造成糖尿病创面难以愈合的最重要因素[13-15]。随着分子生物学及其相关技术的不断发展，学者也在不断探索糖尿病溃疡性病变的分子机制以及微观层面的特征。本研究针对外周血miRNA 表达状态进行了分析，提示3组受试者miRNA-198表达水平存在差别,进一步做两两比较发现，溃疡组水平分别高于单纯糖尿病组和健康组水平，差异均有统计学意义(P<0.05)，单纯糖尿病与健康组间差异无统计学意义(P>0.05)。其原因可能是糖尿病患者未愈合的伤口组织中长期存在miR-198，其在受损皮肤中高表达抑制了正常的皮肤受损miR-198 生成。鉴于miRNA是一种高度保守的非编码RNA，在其调控各种病理生理的过程中是否会受到其他环境及患者自身因素的影响。本文就miRNA-198表达水平及其他相关潜在影响因素与糖尿病难治性溃疡之间的相关性进行了回归分析，结果提示miRNA-198表达水平高、超重/肥胖状态、饮酒史、高血压现病史以及高血压和糖尿病家族史均是糖尿病难治性溃疡发生的高危因素。其原因可能是这些因素均会加剧局部炎症，使患者皮肤易感性增加，同时长期的慢性创面感染状态引发的细菌感染和局部肉芽老化等病理过程的出现，以及包膜纤维化出现，都可以致创面不易愈合[15]。

综上所述，miRNA-198的表达与难治性糖尿病性溃疡之间存在相关性，miRNA-198在外周血中的表达增高存在于难治性糖尿病性溃疡的病理过程之中，影响了伤口的正常愈合机制。

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